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Aislamiento, caracterización de cepas de actinomicetos

Aislamiento, caracterización de cepas de actinomicetos

Los actinomicetos son microorganismos que se encuentran ampliamente distribuidos en diferentes tipos de suelos, aunque también se pueden encontrar en ambientes acuáticos y como comensales o parásitos de animales y plantas. 1

Aislamiento, caracterización de cepas de actinomicetos

Universidad de Granma

Centro de estudios de química aplicada

Autores:

Lic. María Antonia Salas González. Licenciada en Tecnología de la Salud en Servicios Farmacéuticos. Hospital Celia Sánchez Manduley

Dr.C. Profesor Titular Alejandro Alarcón Zayas. UDG Departamento de Química

MSc: Sandra Rodés Reyes. Profesora Asistente UDG .Departamento de Química

MSc: Yuleidis Arias Villavicencio. UDG Departamento de Biología

RESUMEN

Introducción:

Los principales géneros aislados a partir de suelos son Nocardia, Streptomyces y Micromonospora, que pueden estar presentes como conidias o como hifas vegetativas. Estos microorganismos están considerados como organismos promotores del crecimiento vegetal (OPCV), debido a que median una serie de mecanismos favorables para las plantas que pueden ser directos o indirectos tales como: fijación biológica de nitrógeno, solubilización de iones fosfato, producción de quelantes de hierro (sideróforos), fitohormonas y antibióticos, entre otros. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10

Objetivo: Aislar y caracterizar mediante técnicas microbiológicas de diferentes cepas de actinomicetos tolerantes a la salinidad.

Métodos: Las muestras de suelo se tomaron cerca de la zona radical de varias plantas de diferentes ecosistemas (marinos y terrestres) a una profundidad de 15 cm, las cuales se colectaron en frascos estériles. Las muestras de sedimentos marinos se tomaron a una profundidad de 1 m de la superficie del agua y excavando unos 5-10 cm en el sedimento. La mayor parte de las muestras provienen de suelos originalmente salinos (zona costera) y algunos de suelos salinizados fueron tomados del municipio Manzanillo, excepto M12 que proviene de un suelo no salino de la zona aledaña a la Universidad de Granma (Tabla 1). Se procedió al aislamiento de cepas de actinomicetos tolerantes a la salinidad. Luego se realizó la caracterización cultural de cepas de actinomicetos. Posteriormente al mantenimiento de las mismas.

Resultados: En resumen (Tabla 3), fue posible aislar 25 cepas de actinomicetos tolerantes a la salinidad a partir de suelo rizosférico de diferentes especies vegetales, localizado en la costa sur y en el centro de Granma. La mayoría de las colonias aisladas mostraron características culturales distintivas; sin embargo, de manera general son circulares, de bordes enteros o lobulados, elevadas hacia el centro y con presencia de estrías. Casi todas las cepas presentaron colonias de aspecto duro y color blanco en alguna parte de su estructura. Las cepas A3M4, A10M7 y A20M10 mostraron ser muy diferentes al resto dado que crecieron inmersas en el medio de cultivo y solo emergió una parte de la colonia con las estructuras reproductoras, lo cual puede ser indicativo de un bajo requerimiento de oxígeno (microorganismos microaerofílico).

Conclusiones: Se caracterizaron morfológicamente 25 cepas de actinomicetos aisladas a partir de muestras de suelo rizosférico de varias especies vegetales, predominando colonias circulares, de aspecto duro, bordes enteros o lobulados, elevadas hacia el centro, presencia de estrías y color blanco en alguna parte de su estructura. Las cepas A3M4, A10M7 y A20M10 son muy diferentes al resto dado que crecieron inmersas en el medio de cultivo y solo emergió una parte de la colonia con las estructuras reproductoras.

Palabras clave: Actinomicetos, microorganismos, rizosférico

Introducción

Los actinomicetos son microorganismos que se encuentran ampliamente distribuidos en diferentes tipos de suelos, aunque también se pueden encontrar en ambientes acuáticos y como comensales o parásitos de animales y plantas. 1 Los principales géneros aislados a partir de suelos son Nocardia, Streptomyces y Micromonospora, que pueden estar presentes como conidias o como hifas vegetativas. Estos microorganismos están considerados como organismos promotores del crecimiento vegetal (OPCV), debido a que median una serie de mecanismos favorables para las plantas que pueden ser directos o indirectos tales como: fijación biológica de nitrógeno, solubilización de iones fosfato, producción de quelantes de hierro (sideróforos), fitohormonas y antibióticos, entre otros. 2,3,4,5,6,7,8,9,10

Métodos

Las muestras de suelo se tomaron cerca de la zona radical de varias plantas de diferentes ecosistemas (marinos y terrestres) a una profundidad de 15 cm, las cuales se colectaron en frascos estériles. Las muestras de sedimentos marinos se tomaron a una profundidad de 1 m de la superficie del agua y excavando unos 5-10 cm en el sedimento. La mayor parte de las muestras provienen de suelos originalmente salinos (zona costera) y algunos de suelos salinizados fueron tomadas del municipio Manzanillo, excepto M12 que proviene de un suelo no salino de la zona aledaña a la Universidad de Granma (Tabla 1).

Aislamiento de cepas de actinomicetos tolerantes a la salinidad

Para el aislamiento de las cepas de actinomicetos a partir de suelos se siguió la metodología sugerida por Baskaran et al. (2011).11 Se pesaron 5 g de suelo rizosférico y se enrazó a 50 mL con agua destilada estéril. Se mezcló vigorosamente por 30 min. Se calentaron las muestras a 70 ºC por 15 min para disminuir el número de bacterias no esporuladas. Se realizaron diluciones seriadas decimales: 1 ml de muestra en 9 ml de agua destilada estéril, se agita por 3 min y se repite la acción para el resto de los tubos a partir del precedente. Se inocularon 100 µL de cada dilución en placas Petri conteniendo Agar Caseína-Almidón (ACA)(Anexo 2) con NaCl al 2% extendiendo el inóculo con espátula de Drigalsky y se incubaron durante 20 días a 28 ºC.

Culminado el tiempo de incubación, se aislaron mediante el método de estría o agotamiento las colonias filamentosas de aspecto seco y que mostraron características culturales diferentes. Las cepas se purificaron en ACA empleando el método de obtención de cultivo puro por estría o agotamiento y se mantuvieron frescas por el método de resiembra sólido-sólido. 12, 13

Caracterización cultural de cepas de actinomicetos

La caracterización macro-morfológica de cepas de actinomicetos se basó en la observación de las colonias al microscopio estereoscópico (Novel, China). La caracterización se realizó a colonias de actinomicetos seleccionados y crecidos en medio ACA a 28 ºC durante 7 días. Los aspectos a tener en cuenta incluyen: forma de las colonias (circular, filamentosa, puntiforme, etc.), forma de los bordes (enteros, irregulares, lobulados, etc.), elevación (cóncava, convexa y otras especificaciones), color, apariencia, entre otros.

Mantenimientos de las cepas

Las cepas de actinomicetos se conservaron mediante el método de resiembra sucesiva en medio ACA, Agar Extracto de Malta (AEM) y Agar Müeller-Hinton (AMH); y en crio-conservación a 35 ºC como suspensiones de esporas en glicerol al 60% (v/v).

Resultados

El método de aislamiento de actinomicetos empleado permitió obtener un total de 25 cepas (Tabla 2) a partir de suelos no anegados.

Se realizó la caracterización cultural de las colonias de actinomicetos de las diferentes muestras. En la Figura 2 se muestran colonias de dos actinomicetos (A1 y A2) aislados de suelo costero rizos férrico de Cocoloba uvifera en Manzanillo. En la Figura 3 se pueden observar colonias de tres cepas de actinomicetos aisladas de suelo rizosférico costero de flamboyán en Manzanillo (M4).

Las características culturales de las cepas de actinomicetos que se aislaron a partir de suelo costero rizosférico de Peltopborum ferruginium Benth (flamboyán) en Manzanillo se muestran en la Figura 4. Al realizar la caracterización de las colonias de los actinomicetos aislados a partir de suelo no costero rizosférico de Citrus limon, L. en Manzanillo (Figura 6). A partir de M12 correspondiente a suelo no costero rizosférico de guayaba tomado en Peralejo, Bayamo, se aislaron tres cepas