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Artículo de revisión. La coloración de gram y su importancia en el diagnóstico microbiológico

Artículo de revisión. La coloración de gram y su importancia en el diagnóstico microbiológico

RESUMEN

Este artículo de revisión pretende dar a conocer la importancia de la coloración de Gram como herramienta diagnóstica ya que en primera instancia permite caracterizar tamaño, forma y/o agrupación bacteriana, la reacción tintorial y el germen predominante en una infección o en muestras contaminadas con biota normal.

En esta coloración también es relevante considerar la presencia de la respuesta leucocitaria o respuesta inflamatoria y otro tipo de células como las epiteliales, con el fin de orientar la presencia de infección aguda o crónica y en algunos casos evaluar la calidad de la muestra clínica como sucede con las muestras de esputo.

Artículo de revisión. La coloración de gram y su importancia en el diagnóstico microbiológico

Gloria Inés Morales Parra. Especialista en Microbiología Médica. Docente Universidad de Santander (UDES), Universidad Popular del Cesar (UPC).Valledupar. Colombia

A pesar de que en algunas muestras clínicas esta tinción no tiene valor diagnóstico (faríngeas, nasofaríngeas y con uso muy limitado en muestras de materia fecal), puede ser aplicada a diversos especímenes clínicos como liquido cefalorraquídeo, exudados, orinas, esputo, abscesos y tejidos. La coloración de Gram es en la actualidad, la prueba de laboratorio de microbiología más simple y con el mejor costo efectividad, lo que representa un beneficio para el paciente, el clínico y el laboratorio.

Palabras clave: coloración de Gram, bacterias Grampositivas, bacterias Gram negativas, diagnostico microbiológico.

REVIEW ARTICLE

GRAM STAIN AND ITS IMPORTANCE IN THE MICROBIOLOGICAL DIAGNOSIS

Gloria Inés Morales Parra (1)

ABSTRACT

This review article seeks to highlight the importance of Gram staining as a diagnostic tool because in the first instance to characterize size, shape and / or bacterial group, the dye reaction and germ infection or predominant in biota samples contaminated with normal. This coloration is also relevant to consider the presence of the leukocyte response or inflammatory response and other epithelial cells such as to orient the presence of acute or chronic infection and in some cases to evaluate the quality of the clinical sample as with sputum samples. Although some clinical samples this staining has no diagnostic value (pharyngeal, nasopharyngeal and very limited use in stool samples), can be applied to various clinical specimens as cerebrospinal fluid, exudates, urine, sputum, and tissue abscesses. The Gram stain is currently the microbiology laboratory testing simpler and with the best cost effectiveness, which is a benefit to the patient, the clinician and the laboratory.

Key words: Gram stain, Gram positive bacteria, Gram negative bacteria, microbiological diagnosis.

INTRODUCCIÓN

El advenimiento de las tinciones a mediados del siglo XIX, fue en gran parte, responsable de los principales avances que tuvieron lugar en la microbiología y en otros campos del diagnóstico microscópico durante los últimos 100 años. Desde los inicios de la microbiología la tinción de Gram se ha convertido en una de las tinciones diferenciales más usadas en la Microbiología, como herramienta básica para el diagnostico preliminar y presuntivo del agente infeccioso. Esta coloración diferencial clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: Grampositivas y Gram negativas con base a las diferencias estructurales de sus paredes celulares.

Las características fenotípicas que presentan algunas bacterias contribuyen a su diagnostico presuntivo: la observación de cocos grampositivos dispuestos en racimos sugieren la presencia de estafilococos; la disposición de cocos Grampositivos en cadena indica estreptococos; diplococos Grampositivos en forma de lanceta o con extremos alargados son característicos de S. pneumoniae cuando se observan en esputos, diplococos Gram negativos arriñonados o reniformes son característicos de las especies de Neisseria, bacilos Grampositivos ordenados en letras chinas o empalizadas son típicos del Corynebacterim, bacilos Gram negativos curvos en muestras de heces diarreicas indican especie de Vibrio, o si también se ven en forma de sacacorchos sugieren especies de Campylobacter(1). Además de proveer al microbiólogo y al clínico las características fenotípicas de la bacteria en cuanto a tamaño, forma, agrupación y características tintoriales, esta tinción es importantísima ya que en algunos casos permite la instauración del tratamiento rápido y oportuno.

A pesar de que esta coloración es un procedimiento simple, se debe tener un riguroso control de calidad del frotis, la tinción y el procedimiento, con el fin de minimizar los errores técnicos y mejorar la sensibilidad y especificidad de esta tinción como herramienta para el diagnostico presuntivo del agente infeccioso.

RESEÑA HISTÓRICA

Desde los inicios de la bacteriología, la coloración de Gram se ha convertido en una herramienta fundamental para la taxonomía e identificación bacteriana. Fue ideada por el danés Hans Christian Joachim Gram (1853-1938), un investigador que trabajaba en el laboratorio de Carl Friedlander, el descubridor de la Klebsiella pneumoniae(2). Friedlander había mencionado la técnica de su ayudante en una publicación de 1883, sin darle la valoración debida y el 15 de marzo de 1884 Gram hizo su propia publicación (3). En los años siguientes la utilidad de la técnica se hizo evidente, hasta que en 1889, en la famosa serie de los Précis de…, que publicaba la editorial Mason et fils en París, en el de Microbiología se recomienda someter a todos los cultivos a la tinción de Gram, como primera orientación diagnóstica(4). A pesar de que con este valioso aporte Hans C. J. Gram entraba en la galería de los inmortales, se cree que no supo valorar la trascendencia de su método de coloración y esto se pudo observar cuando escribió «He publicado un método, aunque estoy consciente de que todavía es defectuoso e imperfecto; pero deseo que en manos de otros investigadores pueda resultar de utilidad». Hoy en día la coloración de Gram es una de los pilares del diagnóstico temprano de las infecciones bacterianas (5).

Posteriormente, el conocimiento de las estructuras de las membranas bacterianas, en cuanto al aspecto físico y su composición molecular demostraron que la coloración de Gram distingue dos grupos de bacterias muy diferentes. Las bacterias Grampositivas que presentan una gruesa capa de peptidoglicano, y las Gram negativas con una delgada capa de peptidoglicano, a la que se le superpone una capa de lipopolisacárido-lipoproteína, denominada membrana externa. La presencia de esta membrana, marca la diferencia entre las bacterias Gram negativas y las Grampositivas carentes de dicha estructura (6).

Las células Grampositivas debido a sus gruesa paredes de peptidoglicano y la poca cantidad de lípidos no son permeables al alcohol acetona (decolorante) puesto que este deshidrata la pared celular y cierra los poros, alterando y afectando el pequeño espacio entre las moléculas. El complejo cristal violeta-yodo queda atrapado dentro de la pared celular tiñendo a las bacterias Grampositivas de color azul (7). Las bacterias Gramnegativas tienen espacios en la estructura de su pared celular y el alcohol acetona es un solvente de lípidos que actúa sobre la membrana exterior de la pared celular afectando la membrana citoplasmática donde se unen las moléculas que componen el peptidoglicano. De igual manera, la delgada capa de peptidoglicano no es capaz de retener el complejo cristal violeta-yodo lo cual obliga a las células Gram negativas a decolorarse, necesitando entonces la adición de la safranina o la fuscina como colorante de contraste para colorearse de rosado (8).

TINCIÓN DE GRAM COMO HERRAMIENTA DIAGNOSTICA

La tinción de Gram es de gran utilidad para realizar el examen directo de muestras clínicas, porque permite determinar la calidad de ellas, la respuesta inflamatoria, la naturaleza y cantidad de microorganismos presentes y el germen predominante en una infección mixta o con muestras contaminadas con biota normal. Adicionalmente, se puede correlacionar el resultado del examen directo con el resultado de los cultivos y de esta manera, disponer de un adecuado control de calidad. Este examen tiene valor diagnostico y es de informe inmediato en muestras de liquido cefalorraquídeo y líquidos corporales, esputo, sangre, orina, abscesos, y secreciones (uretral, cervical y vaginal). No tiene valor diagnostico en muestras faríngeas y nasofaríngeas ya que la biota observada hace parte de la flora normal de estos sitios anatómicos. Es de uso limitado en muestras de materia fecal (el diagnostico presuntivo de infecciones por Campylobacter sp.)(9).

El diagnóstico rápido de microorganismos presentes en fluidos corporales estériles, como el líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, peritoneal o articular, es de gran importancia para el diagnóstico de infecciones que, en estas localizaciones, son generalmente graves y secuelantes. La tinción de Gram constituye una herramienta de gran utilidad en el diagnóstico etiológico; sin embargo, la sensibilidad de esta técnica es variable según el tipo de muestra y la carga bacteriana presente en ella. La concentración de la muestra, como un paso previo a su tinción mejora el rendimiento, por lo que es recomendable su uso de rutina (10).

Chapin y colaboradores han demostrado que la centrifugación (CT) y la citocentrifugación (CC) de los fluidos corporales estériles permite reducir la cantidad de muestra necesaria y obtener preparaciones uniformemente concentradas en un área de 6 mm de diámetro, aumentando el rendimiento de la técnica y la sensibilidad en la observación bacteriana y celular (11). Díaz y col. demostraron que la sensibilidad para centrifugación v citocentrifugación fue de 89% y 61%, respectivamente. La especificidad fue de 100% para ambas técnicas. En una evaluación cuantitativa de la celularidad de las muestras, se observó un aumento de los leucocitos en la centrifugación con respecto a citocentrifugación. Estos resultados muestran que la centrifugación puede ser de gran ayuda en el diagnóstico rápido de las infecciones de fluidos corporales con baja carga bacteriana. Presenta una mayor sensibilidad y facilita la visualización de bacterias, especialmente en muestras con bajo recuento celular (10), por lo que debería implementarse en los laboratorios.

Esta tinción, constituye por lo tanto un apoyo indiscutible contra las enfermedades infecciosas y aumenta su valor en lo relativo a instaurar una terapia rápida permitiendo la selección de los antibióticos apropiados (12). Las siguientes patologías, son algunos ejemplos en donde la tinción de Gram se convierte en una herramienta importantísima para el diagnostico presuntivo y definitivo del agente infeccioso:

VAGINOSIS BACTERIANA

La vaginosis bacteriana (VB) es un desorden del ecosistema vaginal caracterizado por un cambio en la flora vaginal (Lactobacilos) por microorganismos anaerobios que incluyen G. vaginalis, Mobiluncus sp, Prevotella, Bacteroides sp, Peptostreptococcus sp, entre otros, siendo la G. vaginalis el morfotipo más comúnmente implicado en este síndrome (13). En la vaginosis bacteriana, el cultivo tiene una baja sensibilidad y especificidad, ya que esta patología no se encuentra en el 50% de las mujeres de las cuales se aisló G. vaginalis (14,1,15). Además, algunas bacterias como el Mobiluncus son de lento crecimiento y tardan hasta 10 días de incubación a 35º C para obtener colonias puntiformes de menos de 1 mm de diámetro (16).

Varios estudios han demostrado que la tinción de Gram tiene una muy buena correlación con el diagnostico de vaginosis bacteriana (17,18, 19). Nugent y col, idearon un método de cuantificación para mejorar la correlación del Gram con la vaginosis bacteriana. Cada morfotipo bacteriano encontrado en la coloración (Bacilos grampositivos: Lactobacillus sp., cocobacilos Gram variables: G. vaginalis + Bacteroides sp. y bacilos curvos Gramnegativos: Mobiluncus) es cuantificado de 1+ a 4+. Una vez establecida la cantidad de bacterias se les asigna un puntaje: Si la suma de los puntajes es 7 o más, es compatible con vaginosis bacteriana; 4 a 6 es denominado ‘intermedio’ y 0 a 3, normal (20). Una notable ventaja del Gram vaginal, es que ha demostrando muy buena correlación con el diagnóstico clínico, siendo, además, rápido y de bajo costo. Además, permite observar alteraciones de la flora vaginal sin que existan evidencias clínicas de vaginosis bacteriana, razón por la cual ha sido considerado por diversos autores como una técnica objetiva, con un nivel elevado de reproducibilidad en las distintas poblaciones estudiadas (21, 22).

A pesar de que el sistema de puntuación de Nugent tiene buena validez, exce­lente capacidad diagnóstica y altamente reproduci­ble para el diagnóstico de vaginosis bacteriana (23, 24, 25) algunos autores afirman que a pesar que los parámetros de Nugent tienen muy buena sensibilidad y especificidad, deben ir mancomunados a los criterios de Amsel y col. establecidos como estándar para indicar la presencia de la enfermedad (26); esto permite mejorar el diagnostico clínico de este síndrome (27, 28).

ENFERMEDADES DE TRANSMISIÓN SEXUAL

En el diagnóstico precoz de la gonorrea y su tratamiento, la evaluación microscópica representa un elemento importante, ya que es rápido, económico y sencillo. La sensibilidad de la tinción de Gram para detectar N. gonorrrhoeae es próxima al 100% en los casos sintomáticos de uretritis, aunque solo del 50% al 70% en pacientes asintomáticos. La sensibilidad en ambos grupos se acerca al 100%, es decir, que los resultados falsos positivos son excepcionales (29). El diagnóstico presuntivo de infección por Neisseria gonorrhoeae en hombres sintomáticos, se realiza a partir de frotis de exudados uretrales coloreados por Gram, al observarse los típicos diplococos Gram negativos dentro de leucocitos polimorfonucleares, representando una herramienta clave para el diagnóstico de