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Tipificación fenotípica y molecular de Staphylococcus aureus meticilino resistente y comparación de métodos para detectar resistencia a meticilina

López de la ciudad de Valledupar o que solicitaron sus servicios por consulta externa o urgencias. La muestra estuvo determinada por el número de casos confirmados para Staphylococcus aureus. Se excluyeron las cepas que estuvieran erróneamente clasificadas como Staphylococcus aureus o que mostraran contaminación evidente con otro microorganismo. La resistencia fenotípica a la meticilina se evaluó con los métodos agar dilución, microdilución en caldo mediante el sistema automatizado MicroScan (Bio Merieux) utilizando los antibióticos oxacilina y cefoxitin y el método difusión en agar de Kirby Bauer con el antibiótico cefoxitin.

Para evaluar la efectividad de los métodos difusión en agar y microdilución en caldo teniendo en cuenta que estos dos métodos son los más utilizados en los laboratorios de microbiología, se utilizó el análisis estadístico para determinar la asociación entre la variable predictiva (antimicrobiano) y la de desenlace (Sensibilidad y Resistencia). Se calculó para cada una de estas variables su media (Ẋ), desviación estándar (D.E) y significancia estadística – Ver tabla no 1: Análisis estadístico métodos Kirby Bauer (KB) y Microdilución en caldo (CIM) (al final del artículo) Los resultados se extrapolaron a una prueba de hipótesis, con límite de confianza de la zona de aceptación hasta -1,96 y un grado de significancia del 5% – Ver figura no 1: Prueba hipótesis por diferencia de proporciones (al final del artículo).

La detección del gen mecA se realizó mediante reacción en cadena de la polimerasa convencional (PCR), utilizando los primers mecA-Plus: 5’TGGCTATCGTGTCACAATCG3’ (Eurogentec) y mecA-mini: 5’CTGGAACTTGTTGAGCAGAG3’ (Eurogentec), una región altamente conservada del gen mecA de 310 pb descrita por Vannuffel et al (6). Como control interno positivo para verificar género y especie se amplificó el gen nucA que codifica una termonucleasa extracelular presente en todos los Staphylococcus aureus utilizando las secuencias NUC1 5´GCGATTGATGGTGATACGGTT3´ y NUC2 5´AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC3’, fragmento de 279 pb referenciado por Brakstad et al. (7).

Como control negativo de la reacción se utilizó agua en lugar de ADN templete. Este control fue usado a la vez como control ambiental. Todos los ensayos se realizaron por duplicado. Para la PCR se utilizó la Máster Mix que contenía por volumen de reacción para 25 µl: 2,5 µl de tampón (10x), 3.0 µl de MgCl2 (1,5 mM), 2,5 µl de primers mecA y nucA, 0,5 µl de desoxinucleótidos trifosfato (0,4 mM) y 0,5 de Taq polimerasa (5 Uds: Promega). La amplificación se realizó en el termociclador Biorad de acuerdo al siguiente protocolo: desnaturalización a 94°C por 5 minutos, seguido de 40 ciclos a 94°C por 1 minuto, 56°C por 1 minuto y 72°C por 1 minuto, con una extensión final a 72°C por 10 minutos. Los productos amplificados fueron separados mediante electroforesis en gel de agarosa al 3% (Sigma) y teñidos con bromuro de etidio para su posterior visualización con luz UV en un documentador de geles BIO-RAD – Ver figura no 2: Amplificación del gen mecA por PCR (al final del artículo).

Para el análisis estadístico se utilizó el programa estadístico Microsoft Excel 2007 y la tabla de contingencia 2×2 que permitió comparar los métodos fenotípicos de detección de resistencia a meticilina evaluados, determinando la sensibilidad (SEN), especificidad (ESP), valores predictivos y eficiencia (EFC) de cada uno, empleando la presencia del gen mecA como método de referencia.

Para evaluar la efectividad de los métodos fenotípicos al compararlos genotípicamente (PCR), se realizó análisis estadístico para calcular la desviación estándar y los valores del puntaje típico o estándar calculado (Zc). Los resultados fueron extrapolados a una prueba de hipótesis por diferencia de proporciones, con límite de confianza de la zona de aceptación hasta -1,96 y un grado de significancia del 5% – Ver tabla no 2: Análisis estadístico de métodos fenotípicos y genotípicos y figura no 3: Prueba de hipótesis por diferencia de proporciones (al final del artículo).

Como control de calidad para la detección fenotípica y genotípica de la meticilinorresistencia, se utilizaron las cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923 mecA negativo y Staphylococcus aureus ATCC 43300 mecA positivo.

RESULTADOS

La resistencia antimicrobiana es una grave amenaza en Salud Pública. Las cepas de Staphylococcus aureus meticilino resistentes, son de particular interés debido a su virulencia y resistencia a múltiples antibióticos. En esta investigación, la resistencia a meticilina fue del 50% con los tres métodos utilizados, pero al tamizar con el método de microdilución en caldo y el antibiótico oxacilina, el fenotipo de resistencia a este antimicrobiano fue del 52%.

Al extrapolar los resultados del análisis estadístico realizado a los métodos Kirby Bauer y microdilución en caldo a la prueba de hipótesis, se pudo determinar que los dos métodos arrojan resultados confiables ya que la variables de sensibilidad y resistencia cayeron dentro del área de aceptación, por lo tanto, presentan un riesgo bajo de error para detectar de forma confiable el fenotipo de resistencia a meticilina – Ver figura no 1: Prueba hipótesis por diferencia de proporciones (al final del artículo).

Al realizar la PCR convencional para evidenciar la presencia o ausencia del gen mecA, se pudo observar que de los 50 Staphylococcus aureus estudiados, 19 (76%) eran portadores de dicho gen (SARM) cuando se tamizaron con los métodos difusión en agar con el antibiótico cefoxitin y microdilución en caldo con oxacilina y 18 (72%) con los métodos microdilución en caldo con cefoxitin y agar dilución.

Para los métodos fenotípicos evaluados se observó una sensibilidad de 90,4%, la especificidad con valores entre 75,8% y 79,3%, los valores predictivos positivos entre 73% y