Materiales y métodos
Para la toma de muestra de sangre, se recurrió a un individuo sano de sexo masculino, de aproximadamente 40 años de edad, quien reporta no haber estado expuesto a pesticidas, no fumador, no consumidor de bebidas alcohólicas, ni expuesto a agentes reportados como mutacarcinogénicos.
El test de alteraciones cromosómicas se realizó siguiendo el procedimiento descrito por Hoyos- Giraldo L.E (14). Una vez obtenido el consentimiento informado, se tomaron dos muestras de 10 ml de sangre periférica en tubos con heparina. Posteriormente se sembraron 16 gotas de sangre en 7.2 ml de medio RPMI suplementado con suero fetal bovino al 10%. Se indujo la mitosis empleando 280 ul de fitohemaglutinina. Transcurridas 40 horas, se adicionaron las cantidades siguientes de pesticida Malathion disuelto en agua tridestilada: 0, 125, 0.250 y 0.45 mg/ml.
Las muestras se distribuyeron en dos grupos de siete tubos: siete tubos fueron tratados con concentraciones de Malathion durante 24 horas, y los otros siete fueron tratados por un tiempo de 48 horas utilizando las mismas concentraciones de pesticida. El control negativo, correspondía a cultivos de linfocitos sin tratamiento. Los tratamientos se hicieron por duplicado. Se empleó Malathion comercial al 57%. Una vez transcurrido el tiempo de exposición, se adiciono el Colcemid, por un tiempo de dos horas. Las muestras se incubaron durante 7 minutos con una solución hipotónica de KCl 0.082M. Posteriormente se realizaron tres lavados con solución fijadora de metanol: ácido acético 3:1. Se realizó el extendido de las metafases, en dos placas por cada tubo. Finalmente se hizo la coloración con Giemsa al 2%. Para el análisis se evaluaron cien mitosis por cada placa. El análisis estadístico se realizó con el software Statgraphic, con el cual se realizó el análisis de varianza y la prueba de correlación, con una significancia de 95%.
Resultados
Para los cultivos de linfocitos tratados durante 24 horas, se encontró que los linfocitos no tratados con el pesticida Malathion, solo presentaban en promedio 1% de alteraciones cromosómicas, mientras que los linfocitos tratados con diferentes dosis (0.125, 0.250 y 0.456 mg/ml de Malathion) presentaban valores que fueron dosis dependiente, pues a concentraciones más altas de pesticida, mayor fue el promedio de porcentajes de alteraciones cromosómicas, alcanzando valores de 10% en promedio para los linfocitos tratados con dosis de 0.456mg/ml durante un tiempo de 24 horas de tratamiento (tabla 1).
Para el caso de los cultivos tratados durante 48 horas, se observó que alcanzaron el 15% de alteraciones cromosómicas con una concentración de 0.456 mg/ml. El análisis del tipo de alteraciones cromosómicas encontradas, determinó que las alteraciones cromosómicas encontradas corresponden a quiebres de cadena sencilla, y quiebres de cadena doble, y cromosomas dicéntricos con unos valores de 57.37%, 40,98% y 1.64% respectivamente (Ver figura 1).
Concentración (mg/ml Malation) – Alteraciones cromosómicas. 24 horas de tratamiento (promedio) –
Alteraciones cromosómicas 48 horas de tratamiento (promedio)
0 – 1 – 1
0.125 – 3 – 3
0.250 – 5 – 7
0.456 – 10 – 15
Tabla 1. Resultado de alteraciones cromosómicas en cultivos de linfocitos humanos tratados con Malathion a concentraciones de 0, 0.125, 0.250 y 0.456 mg/ml durante 24 48 horas.
Al comparar los resultados obtenidos para las dosis de 0.25 y 0.45mg/ml, en los dos tiempos analizados, se puede observar el incremento de alteraciones cromosómicas en los linfocitos tratados durante 48 horas en comparación a los tratados durante 24 horas, lo cual indica que a mayor tiempo de exposición mayor es el nivel de daño genético producido (ver figura 2).
En las células tratadas durante 48 horas con dosis de 0.45 mg, se observaron células con más de dos alteraciones cromosómicas, efecto que no se observó en las células tratadas por 24 horas. Al realizar el análisis de varianza, se determinó que el valor de p es menor de 0.001, lo cual demuestra una relación estadísticamente significativa entre el tiempo, la concentración y el número de aberraciones cromosómicas, a un nivel de confianza de 99%. Se observa una relación proporcional entre la concentración del pesticida y el porcentaje de alteraciones cromosómicas encontradas.
También se pudo determinar que el tiempo de exposición al pesticida Malathion, influye en la frecuencia de las alteraciones cromosómicas, pues se obtuvieron mayores niveles de daño en las células tratadas durante 48 horas de exposición, en comparación a las tratadas durante un tiempo de 24 horas. El Coeficiente de correlación de 0.90, lo cual indica la relación existente entre la frecuencia de alteraciones cromosómicas y las concentraciones de Malathion analizadas en el presente estudio. El Malathion es un pesticida organofosforado frecuentemente utilizado en labores agrícolas en muchos países, incluyendo Colombia.
En India, se han reportado resultados positivos de asociación entre mezclas de pesticidas, tales como el Malathion, Metyl Paration, DDT, Toxafeno entre otros, e incremento en los niveles de daño en el ADN (16, 17). En cuatro estudios diferentes realizados con ratas, se observan resultados positivos de asociación, destacándose la capacidad de incrementar el nivel de daño en el ADN y la formación de tumores mamarios, en mezcla con el Metil Paration (12,18,19,20). Adicionalmente se han realizado estudios in vivo empleando ratones, y se ha demostrado que el pesticida evaluado en este estudio, induce daño a nivel del ADN cuando se emplean concentraciones de 2.5, 5 y 10 mg/ml (21).
Figura 1. Cromosomas dicéntricos (A) y fracturas cromatídicas (B) observadas en los linfocitos humanos tratados con Malathion.