{"id":32670,"date":"2015-03-23T13:12:08","date_gmt":"2015-03-23T12:12:08","guid":{"rendered":"http:\/\/www.revista-portalesmedicos.com\/revista-medica\/?p=32670"},"modified":"2015-03-23T13:12:35","modified_gmt":"2015-03-23T12:12:35","slug":"sangre-oculta-hemorragia-digestiva-orina","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.revista-portalesmedicos.com\/revista-medica\/sangre-oculta-hemorragia-digestiva-orina\/","title":{"rendered":"Presentaci\u00f3n de una nueva t\u00e9cnica de elaboraci\u00f3n propia, manual y automatizada, ultrasensible y cuantitativa, para la determinaci\u00f3n de sangre oculta en hemorragias digestivas altas y bajas, en orina y en otros l\u00edquidos biol\u00f3gicos"},"content":{"rendered":"

Presentaci\u00f3n de una nueva t\u00e9cnica de elaboraci\u00f3n propia, manual y automatizada, ultrasensible y cuantitativa, para la determinaci\u00f3n de sangre oculta en hemorragias digestivas altas y bajas, en orina y en otros l\u00edquidos biol\u00f3gicos<\/strong><\/h3>\n

RESUMEN: <\/strong><\/p>\n

Los m\u00e9todos para investigar sangre oculta pueden ser qu\u00edmicos o inmunol\u00f3gicos. Los primeros tienen mala sensibilidad y especificidad, pero sirven para evaluar hemorragias digestivas altas y bajas. Los segundos son muy sensibles y espec\u00edficos pero detectan \u00fanicamente sangrados colorrectales. Algunos de estos \u00faltimos tienen la ventaja indudable de ser cuantitativos. Se presenta un m\u00e9todo qu\u00edmico de excelente sensibilidad y especificidad, ultrasensible y cuantitativo, basado en el m\u00e9todo cromog\u00e9nico de la 4-aminofenazona.<\/p>\n

<\/p>\n

Presentaci\u00f3n de una nueva t\u00e9cnica de elaboraci\u00f3n propia, manual y automatizada, ultrasensible y cuantitativa, para la determinaci\u00f3n de sangre oculta en hemorragias digestivas altas y bajas, en orina y en otros l\u00edquidos biol\u00f3gicos<\/strong><\/p>\n

Lautaro Fidel Bracco, Bioqu\u00edmico de la Universidad de Buenos Aires (UBA). Becario Doctoral de CONICET. Doctorando de Ingenier\u00eda de Procesos Industriales y Biotecnolog\u00eda. Asesor de Investigaci\u00f3n y Desarrollo de Procesos del Laboratorio Gamma Nuclear.<\/p>\n

Malco Fidel Benjamin Bracco. T\u00e9cnico Universitario en Ciencias Experimentales. Estudiante avanzado de Licenciatura en Ciencias Qu\u00edmicas de la Universidad de Belgrano, de la ciudad aut\u00f3noma de Buenos Aires. Pasante del Laboratorio Gamma Nuclear.<\/p>\n

Jos\u00e9 Luis Bracco, Bioqu\u00edmico, Master en Nutrici\u00f3n y Biotecnolog\u00eda Alimentaria de la Universidad Europea Miguel de Cervantes. Jefe del Laboratorio Gamma Nuclear, Galarza 1082\/86, Concepci\u00f3n del Uruguay, Argentina.<\/p>\n

PALABRAS CLAVE: <\/strong>sangre oculta, hemorragias digestivas altas y bajas, m\u00e9todo cromog\u00e9nico cuantitativo, -4 aminofenazona.<\/p>\n

    \n
  1. INTRODUCCI\u00d3N Y ESTADO DEL ARTE:<\/strong><\/li>\n<\/ol>\n

    Los m\u00e9todos que usualmente se emplean para la determinaci\u00f3n de sangre oculta en materia fecal, pueden ser qu\u00edmicos o inmunol\u00f3gicos. Los m\u00e9todos qu\u00edmicos se basan en la habilidad peroxidasa s\u00edmil de la hemoglobina y del grupo hem, de oxidar un reactivo cromog\u00e9nico en presencia de per\u00f3xido de hidr\u00f3geno, desarrollando color.<\/p>\n

    El m\u00e9todo de la ortotoluidina se basa en la actividad peroxidasa de la hemoglobina, o de oxidantes no espec\u00edficos, de catalizar la reacci\u00f3n del per\u00f3xido de hidr\u00f3geno y el crom\u00f3geno ortotoluidina, para formar o-toluidina oxidada de color azul. Es m\u00e1s sensible que el m\u00e9todo cl\u00e1sico, reaccionando con m\u00ednimas cantidades de sangre, o de peroxidasas y otros agentes oxidantes, por lo que produce muchos falsos positivos, lo cual le otorga un gran valor a los test negativos como diagn\u00f3stico de ausencia de sangrado intestinal. El m\u00e9todo del guayacol, por el contrario, tiene una sensibilidad baja lo que le concede valor a las pruebas positivas, que denotan la existencia de sangrado intestinal. El HemoQuant se basa en la detecci\u00f3n de derivados porfir\u00ednicos de la hemoglobina. Es m\u00e1s espec\u00edfico que el m\u00e9todo del guayacol.<\/p>\n

    Los m\u00e9todos que usan la reacci\u00f3n de la peroxidasa tienen la gran ventaja de ser econ\u00f3micos y de evaluar hemorragias digestivas altas y bajas, pero tienen como desventajas la baja sensibilidad y la baja especificidad, con resultados falsos negativos y falsos positivos.<\/p>\n

    Los m\u00e9todos m\u00e1s modernos, de tipo inmunol\u00f3gico, como la aglutinaci\u00f3n inmunoqu\u00edmica de l\u00e1tex, la inmunodifusi\u00f3n radial simple y la hemoaglutinaci\u00f3n reverso pasiva, han sido m\u00e9todos m\u00e1s sensibles a las concentraciones bajas de hemoglobina humana en heces. Los estudios cl\u00ednicos indican que los resultados de la prueba son positivos, \u00fanicamente, en 50 a 60% de pacientes con c\u00e1ncer colorrectal y, solamente, en 25 a 30% de pacientes con p\u00f3lipos. Por lo tanto m\u00e9todos mejores y m\u00e1s sensibles para detectar sangre oculta fecal son importantes para el diagnostico de enfermedades que dan lugar a sangrado gastrointestinal.<\/p>\n

    La inmunocromatograf\u00eda r\u00e1pida, comercializada tambi\u00e9n como Hemosure iFOB y otras marcas, revela niveles inferiores de sangre oculta fecal empleando un m\u00e9todo inmunoespec\u00edfico de captura del doble sandwich. Los resultados positivos pueden ser vistos si los niveles de hemoglobina en las heces son tan bajos como 0.05 \u00b5g Hb\/ml, es decir 50 ng de Hb\/ml.<\/p>\n

    La prueba Hemosure iFOB es espec\u00edfica para hemoglobina humana. La hemoglobina de caballo, cerdo, pez, res, gallinas, conejos, ratas, cabras y ratones no reaccionan con esta prueba. La muestra fluye a trav\u00e9s del dispositivo absorbente; el anticuerpo, marcado con un colorante, se conjuga con la hemoglobina de la muestra y forma un complejo ant\u00edgeno-anticuerpo. Este complejo enlaza al anticuerpo anti-hemoglobina en la zona de reacci\u00f3n positiva de la prueba y produce una banda de color rosado. En ausencia de hemoglobina, no hay l\u00ednea en la zona de reacci\u00f3n positiva de la prueba. Los extractos acuosos de mel\u00f3n, coliflor, nabo, r\u00e1bano, j\u00edcama, y 20 mg\/ml de soluci\u00f3n de peroxidasa, no interfieren en el resultado.<\/p>\n

    La desventaja de estos m\u00e9todos inmunol\u00f3gicos reside en que reaccionan contra la mol\u00e9cula de hemoglobina \u00edntegra y, por lo tanto, no eval\u00faan hemorragias digestivas altas; \u00fanicamente pueden ser empleados cuando se sospecha sangrado colorrectal.<\/p>\n

    Presentamos en este trabajo un m\u00e9todo autom\u00e1tico y manual, ultrasensible y cuantitativo, de elaboraci\u00f3n propia, que determina la cantidad de sangre oculta en hemorragias digestivas altas y bajas, en \u00b5g de Hb\/ml y en ng de Hb\/ml, con una sensibilidad similar o mayor que los m\u00e9todos inmunol\u00f3gicos; basado en el m\u00e9todo cromog\u00e9nico de la 4-aminofenazona.<\/p>\n

      \n
    1. MATERIALES <\/strong><\/li>\n<\/ol>\n

      Reactivos:<\/p>\n

        \n
      • Reactivo 1: 4- aminofenazona (4-AF) 25 mmol\/l en buffer TRIS 0.92 mol\/l<\/li>\n
      • Reactivo 2: Fenol, 55 mmol\/l<\/li>\n
      • Reactivo 3: Per\u00f3xido de hidr\u00f3geno de 2 vol\u00famenes<\/li>\n<\/ul>\n
          \n
        1. T\u00c9CNICA <\/strong><\/li>\n<\/ol>\n
            \n
          • Diluir la materia fecal en agua destilada: un pitsk<\/li>\n<\/ul>\n

            (pizca) o knifepoint (punta de cuchillo) de materia fecal en 10 ml de agua<\/p>\n

              \n
            • Agitar 5 minutos en agitador<\/li>\n
            • Centrifugar a 3000 r.p.m.<\/li>\n
            • Usar el sobrenadante<\/li>\n<\/ul>\n

              Si el sobrenadante no es l\u00edmpido o presenta alguna coloraci\u00f3n puede ser necesario a\u00f1adir un Blanco de Muestras, con 50\u00b5l del sobrenadante m\u00e1s un mililitro de agua destilada.<\/p>\n

              T\u00e9cnica Manual:<\/span><\/strong><\/p>\n

              Ver: Tablas – determinaci\u00f3n de sangre oculta, al final del art\u00edculo<\/p>\n

              Leer el color magenta producido en espectrofot\u00f3metro a 505 nm.<\/p>\n

              Corregir las lecturas del desconocido y del est\u00e1ndar rest\u00e1ndoles la lectura del blanco.<\/p>\n

              Resultado:(Hemoglobina del Est\u00e1ndar en mg\/dl x Lectura del Desconocido) % Lectura del Est\u00e1ndar<\/p>\n

              T\u00e9cnica Autom\u00e1tica<\/span><\/strong>:<\/strong><\/p>\n

                \n
              • Reactivo 1: reactivo 4-AF 1:50 + reactivo de fenol 1:50<\/li>\n
              • Reactivo 2: agua oxigenada de 2 vol\u00famenes<\/li>\n
              • FICHA T\u00c9CNICA DEL AUTOANALIZADOR<\/span>:<\/li>\n
              • TIPO: \u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 Color<\/li>\n
              • REFERENCIA: \u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 Factor<\/li>\n
              • LONGITUD DE ONDA: \u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 505 nm<\/li>\n
              • UNIDADES: \u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 \u00b5g\/ml o ng\/ml<\/li>\n
              • VOLUMEN MUESTRA: 100 \u00b5l<\/li>\n
              • VOLUMEN 1\u00ba REACTIVO: 200 \u00b5l<\/li>\n
              • VOLUMEN 2\u00ba REACTIVO: 100<\/li>\n
              • 1\u00ba INCUBACI\u00d3N:\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 \u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 10 MINUTOS<\/li>\n
              • LIMITE INFERIOR: \u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 0<\/li>\n
              • LIMITE SUPERIOR \u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 2560<\/li>\n
              • BL\/\/L.SUSTRATO: 0.150<\/li>\n
              • TESTIGO: 129 \u00b5g\/ml<\/li>\n
              • FACTOR: 1100<\/li>\n<\/ul>\n

                Sensibilidad:\u00a0\u00a0\u00a0 La sensibilidad es del orden de 25 a 40 ng de Hb\/ml<\/p>\n

                Sensibilidad de otros m\u00e9todos:<\/p>\n

                  \n
                • Inmunol\u00f3gico: 200 ng Hb\/ml<\/li>\n
                • Inmunocromatogr\u00e1fico: 50 ng Hb\/ml<\/li>\n<\/ul>\n

                  El presente m\u00e9todo es cuantitativo, en sus versiones manual y automatizada, como los mejores m\u00e9todos autom\u00e1ticos existentes en el mercado, considerados en la actualidad los procedimientos gold est\u00e1ndar de la investigaci\u00f3n de sangre oculta; aunque aventaja a dichos m\u00e9todos en la posibilidad de valorar hemorragias digestivas altas y bajas.<\/p>\n

                  En los m\u00e9todos autom\u00e1ticos cuantitativos de Fecatest por aglutinaci\u00f3n de part\u00edculas de l\u00e1tex, el rango de detecci\u00f3n va de 0 a 1200 ng Hb\/ml de buffer. Esto permite predeterminar el punto de corte para un resultado positivo, que se ha fijado en 100 ng Hb\/ml que es lo recomendado por los fabricantes.<\/p>\n

                  En el m\u00e9todo que presentamos el rango de detecci\u00f3n va desde 0 a m\u00e1s de 1280 \u00b5g Hb\/ml, y la sensibilidad es del orden de 25 a 40 ng Hb\/ml. El punto de corte se ha fijado en 45 ng de Hb\/ml.<\/p>\n

                    \n
                  1. RESULTADOS:<\/strong>\n
                      \n
                    • EN OTROS L\u00cdQUIDOS BIOL\u00d3GICOS: <\/strong>Se estudi\u00f3 la performance del m\u00e9todo en muestras de orina sospechosas, sin centrifugar, usando como est\u00e1ndar una diluci\u00f3n 1:1000 de sangre de hemoglobina valorada o conocida, y como est\u00e1ndar interno el n\u00famero de hemat\u00edes del sedimento.<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ol>\n

                      Ver: Tablas – determinaci\u00f3n de sangre oculta, al final del art\u00edculo<\/p>\n

                      En consecuencia:<\/p>\n

                        \n
                      • Los valores esperados para el sangrado macrosc\u00f3pico son > 120 \u00b5g de Hb\/ml.<\/li>\n
                      • Los valores esperados para el sangrado microsc\u00f3pico (oculto) son < 120 \u00b5g de Hb\/ml.<\/li>\n
                      • La m\u00ednima lectura capaz de resolver el m\u00e9todo es de 42 ng\/ml, equivalente a una suspensi\u00f3n que, centrifugada, arroja un resultado del sedimento de 6 hemat\u00edes por campo 400x. (Gr\u00e1fico n\u00ba1, anexo)<\/li>\n<\/ul>\n

                        4.2. EN MATERIA FECAL NORMAL<\/strong>: Un paciente joven, normopeso, cl\u00ednicamente normal, sin signos de sangrado gastroent\u00e9rico, sometido durante 3 d\u00edas a una dieta con sobrecarga de carnes rojas, verduras verdes, y a cepillado dental habitual, arroj\u00f3 el siguiente resultado de la sangre oculta en la primera materia fecal del cuarto d\u00eda, con continuaci\u00f3n de la dieta.<\/p>\n

                        Lectura del desconocido:\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 \u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 0.128<\/p>\n

                        Lectura del blanco de reactivos:\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 0.014<\/p>\n

                        Lectura del blanco de muestra: 0.112<\/p>\n

                        Lectura del desconocido \u2013 (Lectura del blanco de reactivos + Lectura del blanco de muestra) = 0.128 \u2013 0.126 = 0.002<\/p>\n

                        Desconocido = 0.002 X 10.66 = 0.0213 \u00b5g\/ml = 21.3 ng\/ml<\/p>\n

                        Donde 10.66 es el Factor en esa zona de la curva.<\/p>\n

                        El punto de corte se fija en 2 veces el valor obtenido en un paciente normal, sin restricciones diet\u00e9ticas, con el prop\u00f3sito de descartar alg\u00fan eventual falso positivo, entonces:<\/p>\n

                          \n
                        • Negativo: \u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 < 45 \u00a0\u00a0\u00a0 ng\/ml<\/li>\n
                        • Positivo d\u00e9bil: 45-90 \u00a0\u00a0 ng\/ml<\/li>\n
                        • Positivo: \u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 > 90 ng\/ml<\/li>\n<\/ul>\n

                          4.3.<\/strong> EN EXTRACTOS VEGETALES: <\/strong>Se evalu\u00f3 la utilidad del m\u00e9todo para determinar peroxidasa en extractos vegetales, de importancia para encontrar fuentes de enzima para fines biotecnol\u00f3gicos. Es conocida la peroxidasa del r\u00e1bano (horseradish peroxidase o HRP), que tiene grandes aplicaciones en t\u00e9cnicas inmunoqu\u00edmicas y de diagn\u00f3stico cl\u00ednico debido a su gran estabilidad, facilidad de conjugaci\u00f3n con las inmunoglobulinas y sencillez para ser detectada por m\u00e9todos colorim\u00e9tricos utilizando un gran n\u00famero de reactivos como fenoles, aminas arom\u00e1ticas, mol\u00e9culas org\u00e1nicas complejas como el ABTS \u00f3 2,2\u2032-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ioduro y glutati\u00f3n.<\/p>\n

                          Se utiliz\u00f3 un extracto acuoso de harina de soja (50% p\/v), el cual arroj\u00f3 el siguiente resultado:<\/p>\n

                          Lectura del extracto:\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 0.090<\/p>\n

                          Lectura del blanco:\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 0.014<\/p>\n

                          Factor en esa zona de la<\/p>\n

                          <\/p>\n

                          curva: \u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 10.66<\/p>\n

                          Resultado:\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 810 ng \/ml<\/p>\n

                          Una soluci\u00f3n de 0.034 U de oxidasas (0.03 U oxidasas + 0.004 U de peroxidasa) evaluada con este m\u00e9todo produjo una lectura L = 0.020, correspondiente a una concentraci\u00f3n de (0.020-0.014) x 10.66 = 0.64 \u00b5g\/ml equivalente a 640 ng\/ml. De donde se determina que el extracto acuoso de harina de soja empleado (50% p\/v) contiene 0.043 U de oxidasa.<\/p>\n

                            \n
                          1. ANEXO<\/strong><\/li>\n<\/ol>\n

                            Ver: Tablas – determinaci\u00f3n de sangre oculta, al final del art\u00edculo<\/p>\n

                            Grafico n\u00ba1: Respuesta del m\u00e9todo (\u00b5g de Hb\/ml) en funci\u00f3n del n\u00ba de hemat\u00edes del sangrado.<\/strong><\/p>\n

                              \n
                            • Punto 1: campo 400x totalmente cubierto<\/li>\n
                            • Punto 2: campo 400x cubierto<\/li>\n
                            • Punto 3: 200 hemat\u00edes por campo 400x<\/li>\n
                            • Punto 4: 12 hemat\u00edes por campo 400x<\/li>\n
                            • Punto 5: 6 hemat\u00edes por campo 400x<\/li>\n<\/ul>\n

                              (Elaboraci\u00f3n propia basada en autor)<\/p>\n

                              Tablas – determinaci\u00f3n de sangre oculta<\/strong><\/p>\n