{"id":40073,"date":"2016-11-12T12:45:22","date_gmt":"2016-11-12T11:45:22","guid":{"rendered":"http:\/\/www.revista-portalesmedicos.com\/revista-medica\/?p=40073"},"modified":"2016-11-12T12:46:32","modified_gmt":"2016-11-12T11:46:32","slug":"aislamiento-caracterizacion-cepas-actinomicetos","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.revista-portalesmedicos.com\/revista-medica\/aislamiento-caracterizacion-cepas-actinomicetos\/","title":{"rendered":"Aislamiento, caracterizaci\u00f3n de cepas de actinomicetos"},"content":{"rendered":"

Aislamiento, caracterizaci\u00f3n de cepas de actinomicetos<\/strong><\/h1>\n

Los actinomicetos son microorganismos que se encuentran ampliamente distribuidos en diferentes tipos de suelos, aunque tambi\u00e9n se pueden encontrar en ambientes acu\u00e1ticos y como comensales o par\u00e1sitos de animales y plantas. 1<\/sup><\/p>\n

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Aislamiento, caracterizaci\u00f3n de cepas de actinomicetos<\/strong><\/p>\n

Universidad de Granma<\/strong><\/p>\n

Centro de estudios de qu\u00edmica aplicada<\/strong><\/p>\n

Autores:<\/strong><\/p>\n

Lic. Mar\u00eda Antonia Salas Gonz\u00e1lez. Licenciada en Tecnolog\u00eda de la Salud en Servicios Farmac\u00e9uticos. Hospital Celia S\u00e1nchez Manduley<\/p>\n

Dr.C. Profesor Titular Alejandro Alarc\u00f3n Zayas. UDG Departamento de Qu\u00edmica<\/p>\n

MSc: Sandra Rod\u00e9s Reyes. Profesora Asistente UDG .Departamento de Qu\u00edmica<\/p>\n

MSc: Yuleidis Arias Villavicencio. UDG Departamento de Biolog\u00eda<\/p>\n

RESUMEN<\/strong><\/p>\n

Introducci\u00f3n:<\/strong><\/p>\n

Los principales g\u00e9neros aislados a partir de suelos son Nocardia<\/em>, Streptomyces<\/em> y Micromonospora<\/em>, que pueden estar presentes como conidias o como hifas vegetativas. Estos microorganismos est\u00e1n considerados como organismos promotores del crecimiento vegetal (OPCV), debido a que median una serie de mecanismos favorables para las plantas que pueden ser directos o indirectos tales como: fijaci\u00f3n biol\u00f3gica de nitr\u00f3geno, solubilizaci\u00f3n de iones fosfato, producci\u00f3n de quelantes de hierro (sider\u00f3foros), fitohormonas y antibi\u00f3ticos, entre otros. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10<\/sup><\/p>\n

Objetivo:<\/strong> Aislar y caracterizar mediante t\u00e9cnicas microbiol\u00f3gicas de diferentes cepas de actinomicetos tolerantes a la salinidad.<\/p>\n

M\u00e9todos:<\/strong> Las muestras de suelo se tomaron cerca de la zona radical de varias plantas de diferentes ecosistemas (marinos y terrestres) a una profundidad de 15 cm, las cuales se colectaron en frascos est\u00e9riles. Las muestras de sedimentos marinos se tomaron a una profundidad de 1 m de la superficie del agua y excavando unos 5-10 cm en el sedimento. La mayor parte de las muestras provienen de suelos originalmente salinos (zona costera) y algunos de suelos salinizados fueron tomados del municipio Manzanillo, excepto M12 que proviene de un suelo no salino de la zona aleda\u00f1a a la Universidad de Granma (Tabla 1). Se procedi\u00f3 al aislamiento de cepas de actinomicetos tolerantes a la salinidad. Luego se realiz\u00f3 la caracterizaci\u00f3n cultural de cepas de actinomicetos. Posteriormente al mantenimiento de las mismas.<\/p>\n

Resultados:<\/strong> En resumen (Tabla 3), fue posible aislar 25 cepas de actinomicetos tolerantes a la salinidad a partir de suelo rizosf\u00e9rico de diferentes especies vegetales, localizado en la costa sur y en el centro de Granma. La mayor\u00eda de las colonias aisladas mostraron caracter\u00edsticas culturales distintivas; sin embargo, de manera general son circulares, de bordes enteros o lobulados, elevadas hacia el centro y con presencia de estr\u00edas. Casi todas las cepas presentaron colonias de aspecto duro y color blanco en alguna parte de su estructura. Las cepas A3M4, A10M7 y A20M10 mostraron ser muy diferentes al resto dado que crecieron inmersas en el medio de cultivo y solo emergi\u00f3 una parte de la colonia con las estructuras reproductoras, lo cual puede ser indicativo de un bajo requerimiento de ox\u00edgeno (microorganismos microaerof\u00edlico).<\/p>\n

Conclusiones:<\/strong> Se caracterizaron morfol\u00f3gicamente 25 cepas de actinomicetos aisladas a partir de muestras de suelo rizosf\u00e9rico de varias especies vegetales, predominando colonias circulares, de aspecto duro, bordes enteros o lobulados, elevadas hacia el centro, presencia de estr\u00edas y color blanco en alguna parte de su estructura. Las cepas A3M4, A10M7 y A20M10 son muy diferentes al resto dado que crecieron inmersas en el medio de cultivo y solo emergi\u00f3 una parte de la colonia con las estructuras reproductoras.<\/p>\n

Palabras clave:<\/strong> Actinomicetos, microorganismos, rizosf\u00e9rico<\/p>\n

Introducci\u00f3n<\/strong><\/p>\n

Los actinomicetos son microorganismos que se encuentran ampliamente distribuidos en diferentes tipos de suelos, aunque tambi\u00e9n se pueden encontrar en ambientes acu\u00e1ticos y como comensales o par\u00e1sitos de animales y plantas. 1<\/sup> Los principales g\u00e9neros aislados a partir de suelos son Nocardia<\/em>, Streptomyces<\/em> y Micromonospora<\/em>, que pueden estar presentes como conidias o como hifas vegetativas. Estos microorganismos est\u00e1n considerados como organismos promotores del crecimiento vegetal (OPCV), debido a que median una serie de mecanismos favorables para las plantas que pueden ser directos o indirectos tales como: fijaci\u00f3n biol\u00f3gica de nitr\u00f3geno, solubilizaci\u00f3n de iones fosfato, producci\u00f3n de quelantes de hierro (sider\u00f3foros), fitohormonas y antibi\u00f3ticos, entre otros. 2,3,4,5,6,7,8,9,10<\/sup><\/p>\n

M\u00e9todos<\/strong><\/p>\n

Las muestras de suelo se tomaron cerca de la zona radical de varias plantas de diferentes ecosistemas (marinos y terrestres) a una profundidad de 15 cm, las cuales se colectaron en frascos est\u00e9riles. Las muestras de sedimentos marinos se tomaron a una profundidad de 1 m de la superficie del agua y excavando unos 5-10 cm en el sedimento. La mayor parte de las muestras provienen de suelos originalmente salinos (zona costera) y algunos de suelos salinizados fueron tomadas del municipio Manzanillo, excepto M12 que proviene de un suelo no salino de la zona aleda\u00f1a a la Universidad de Granma (Tabla 1).<\/p>\n

Aislamiento de cepas de actinomicetos tolerantes a la salinidad<\/strong><\/p>\n

Para el aislamiento de las cepas de actinomicetos a partir de suelos se sigui\u00f3 la metodolog\u00eda sugerida por Baskaran et al. <\/em>(2011).11<\/sup> Se pesaron 5 g de suelo rizosf\u00e9rico y se enraz\u00f3 a 50 mL con agua destilada est\u00e9ril. Se mezcl\u00f3 vigorosamente por 30 min. Se calentaron las muestras a 70 \u00baC por 15 min para disminuir el n\u00famero de bacterias no esporuladas. Se realizaron diluciones seriadas decimales: 1 ml de muestra en 9 ml de agua destilada est\u00e9ril, se agita por 3 min y se repite la acci\u00f3n para el resto de los tubos a partir del precedente. Se inocularon 100 \u00b5L de cada diluci\u00f3n en placas Petri conteniendo Agar Case\u00edna-Almid\u00f3n (ACA)(Anexo 2) con NaCl al 2% extendiendo el in\u00f3culo con esp\u00e1tula de Drigalsky y se incubaron durante 20 d\u00edas a 28 \u00baC.<\/p>\n

Culminado el tiempo de incubaci\u00f3n, se aislaron mediante el m\u00e9todo de estr\u00eda o agotamiento las colonias filamentosas de aspecto seco y que mostraron caracter\u00edsticas culturales diferentes. Las cepas se purificaron en ACA empleando el m\u00e9todo de obtenci\u00f3n de cultivo puro por estr\u00eda o agotamiento y se mantuvieron frescas por el m\u00e9todo de resiembra s\u00f3lido-s\u00f3lido. 12, 13<\/sup><\/p>\n

Caracterizaci\u00f3n cultural de cepas de actinomicetos<\/strong><\/p>\n

La caracterizaci\u00f3n macro-morfol\u00f3gica de cepas de actinomicetos se bas\u00f3 en la observaci\u00f3n de las colonias al microscopio estereosc\u00f3pico (Novel, China). La caracterizaci\u00f3n se realiz\u00f3 a colonias de actinomicetos seleccionados y crecidos en medio ACA a 28 \u00baC durante 7 d\u00edas. Los aspectos a tener en cuenta incluyen: forma de las colonias (circular, filamentosa, puntiforme, etc.), forma de los bordes (enteros, irregulares, lobulados, etc.), elevaci\u00f3n (c\u00f3ncava, convexa y otras especificaciones), color, apariencia, entre otros.<\/p>\n

Mantenimientos de las cepas<\/strong><\/p>\n

Las cepas de actinomicetos se conservaron mediante el m\u00e9todo de resiembra sucesiva en medio ACA, Agar Extracto de Malta (AEM) y Agar M\u00fceller-Hinton (AMH); y en crio-conservaci\u00f3n a 35 \u00baC como suspensiones de esporas en glicerol al 60% (v\/v).<\/p>\n

Resultados<\/strong><\/p>\n

El m\u00e9todo de aislamiento de actinomicetos empleado permiti\u00f3 obtener un total de 25 cepas (Tabla 2) a partir de suelos no anegados.<\/p>\n

Se realiz\u00f3 la caracterizaci\u00f3n cultural de las colonias de actinomicetos de las diferentes muestras. En la Figura 2 se muestran colonias de dos actinomicetos (A1 y A2) aislados de suelo costero rizos f\u00e9rrico de Cocoloba uvifera<\/em> en Manzanillo. En la Figura 3 se pueden observar colonias de tres cepas de actinomicetos aisladas de suelo rizosf\u00e9rico costero de flamboy\u00e1n en Manzanillo (M4).<\/p>\n

Las caracter\u00edsticas culturales de las cepas de actinomicetos que se aislaron a partir de suelo costero rizosf\u00e9rico de Peltopborum ferruginium<\/em> Benth (flamboy\u00e1n) en Manzanillo se muestran en la Figura 4. Al realizar la caracterizaci\u00f3n de las colonias de los actinomicetos aislados a partir de suelo no costero rizosf\u00e9rico de Citrus limon, <\/em>L. en Manzanillo (Figura 6). A partir de M12 correspondiente a suelo no costero rizosf\u00e9rico de guayaba tomado en Peralejo, Bayamo, se aislaron tres cepas<\/p>\n

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de actinomicetos cuyas caracter\u00edsticas culturales se muestran en la Figura 7.<\/p>\n

Discusi\u00f3n<\/strong><\/p>\n

Estos resultados son superiores a los obtenidos por Franco y Garc\u00eda (2012), quienes caracterizaron ocho grupos de microorganismos en sistemas agroforestales y solo aislaron una colonia de actinomiceto por tipo de suelo evaluado. 14<\/sup><\/p>\n

Por otro lado Ghorbani-Nasrabadi et al. <\/em>(2013) Realizaron una caracterizaci\u00f3n de actinomicetos mineralizadores de fosfatos en diferentes condiciones ecol\u00f3gicas (suelos forestales, pastizales, suelos de cultivo irrigado, etc.) y determinaron que en todos los suelos el n\u00famero de actinomicetos estuvo por encima de 106<\/sup> ufc\/g de suelo.2<\/sup> En la presente investigaci\u00f3n los resultados fueron siempre por debajo de 103<\/sup> ufc\/mL para todos los tipos de suelos evaluados (datos no mostrados).<\/p>\n

En el medio de cultivo ACA suplementado con antibi\u00f3ticos no se observ\u00f3 el crecimiento de ninguna colonia de actinomiceto a partir de sedimentos marinos ni de r\u00edos. Resultados similares se obtuvieron para el caso del suelo no costero rizosf\u00e9rico de aguacate a partir del cual no se aislaron actinomicetos en las condiciones empleadas. Ambos resultados son incongruentes con los obtenidos por Vijayakumar et al. <\/em>(2012) quienes aislaron 86 tipos morfol\u00f3gicos diferentes a partir de sedimentos marinos utilizando el mismo medio ACA sin suplementarlo con antibi\u00f3ticos e incubado por 10 d\u00edas. 15<\/sup> Estos resultados nos sugieren que existi\u00f3 alg\u00fan problema con el medio de cultivo empleado, causa por la que no se aislaron cepas de actinomicetos a partir de estas muestras de suelo pues, se han aislado actinomicetos incluso de suelos de la Ant\u00e1rtica. 16<\/sup><\/p>\n

Esta baja densidad poblacional de actinomicetos y bajo n\u00famero de tipos morfol\u00f3gicos o ausencia de crecimiento microbiano en los diferentes suelos en estudio puedo estar dado por varios factores. Una de las causas pudo haber sido la utilizaci\u00f3n de antibi\u00f3ticos y el pre-tratamiento de las muestras a 70 \u00baC por 15 min. Sin embargo, Zhang y Zhang (2011) evaluaron diferentes medios de cultivo suplementados con \u00e1cido nalid\u00edxico (50 mg\/L) y nistatina (100 mg\/L) para el aislamiento de actinomicetos a partir de muestras de suelo. 17<\/sup> Estos investigadores obtuvieron que el ACA (Medio de Gause No.1) fue el mejor entre seis medios de cultivo diferentes para lograr una buena diversidad de cepas de actinomicetos al compararlas con la diversidad de actinomicetos determinada mediante an\u00e1lisis gen\u00f3mico de las mismas muestras de suelo.<\/p>\n

Otra explicaci\u00f3n para los resultados obtenidos pudiera ser el hecho de que los sedimentos marinos se tomaron cercanos a la costa, donde hay gran turbulencia a causa de las olas. Tambi\u00e9n es probable que el tiempo de transportaci\u00f3n, as\u00ed como, la existencia de alguna sustancia inhibidora en el agar del medio de cultivo, impidieran el crecimiento exitoso de actinomicetos a partir de estas localidades.<\/p>\n

Fue posible el aislamiento de actinomicetos a partir de seis de las muestras de suelo en evaluaci\u00f3n, de las cuales el suelo costero rizosf\u00e9rico de soplillo mostr\u00f3 la mayor variedad y cantidad de colonias de actinomicetos (Tabla 1). Todos estos suelos fueron rizosf\u00e9ricos de diferentes especies vegetales y s\u00f3lo dos de ellos no fueron costeros. No obstante, como el medio de cultivo fue suplementado con NaCl al 2% todas las cepas crecidas toleran estas concentraciones de salinidad.<\/p>\n

Como se puede observar la cepa A1M2 tiene base cremosa, color amarillo-naranja, centro elevado con micelio a\u00e9reo algodonoso de color blanco ubicado hacia el centro de la colonia, bordes enteros. Micelio vegetativo de color amarillo. La cepa A2M2 presenta borde entero, circular, base cremosa color carmelita, micelio a\u00e9reo color blanco y algodonoso con estr\u00edas radiales.<\/p>\n

La cepa A4M4 tiene bordes enteros inmersos en el medio de cultivo, elevada en el centro con micelio aterciopelado color blanco y una estr\u00eda diametral, base cremosa y aspecto duro. La cepa A5M4 muestra bordes enteros inmersos en el medio de cultivo, elevada en el centro, base cremosa brillante, anillo central conc\u00e9ntrico de aspecto opaco y color gris-carmelita claro, centro con micelio algodonoso de color blanco, estr\u00eda diametral y estr\u00edas circulares conc\u00e9ntricas. La cepa A7M5 muestra colonias circulares, bordes enteros levemente inmersos en el medio de cultivo, base cremosa dura, aspecto brillante y de color amarillo-naranja, elevado en el centro y una depresi\u00f3n puntual en el centro. Muestra adem\u00e1s un anillo algodonoso de color blanco. Para la cepa A8M5 se puede observar en la figura colonias circulares de bordes irregulares y semejantes a micelios aterciopelados y de apariencia opaca, elevaci\u00f3n central de aspecto cremoso, duro y de color gris-blancuzco.<\/p>\n

En el caso de la cepa A9M5 se observa como colonias circulares con bordes irregulares, aspecto micelial aterciopelado, h\u00famedo y de color gris. La cepa A10M5 tiene forma circular de borde circular e irregular, aspecto micelial h\u00famedo, aterciopelado e inmerso en el medio de cultivo y de color gris.<\/p>\n

Las caracter\u00edsticas culturales de las colonias de actinomicetos aislados a partir de suelo no costero rizosf\u00e9rico Lysiloma bahamense<\/em> Benth (soplillo) en Manzanillo (M7) se muestran en la Figura 5. La cepa A6M7 tiene colonias circulares con anillo externo de color blanco algodonoso y uno central de iguales caracter\u00edsticas, pespuntes blancos en la zona intermedia entre los anillos. Sin embargo, la cepa A11M7 es circular con bordes lobulados, colonia elevada con micelio blanco aterciopelado y de aspecto seco, estr\u00eda diametral profunda, otra estr\u00eda diametral menos profunda y estr\u00edas intermedias, as\u00ed como una estr\u00eda circular. La cepa A12M7 tiene forma circular con borde ondulado, anillo externo blanco tupido, zona central m\u00e1s elevada y de color blanco carmelita, estr\u00eda diametral muy profunda.<\/p>\n

El micelio vegetativo es de color blanco-amarillo con una estr\u00eda diametral. La cepa A13M7 revela forma circular con bordes lobulados de color blanco tupido y aterciopelado, colonia elevada hacia el centro con una depresi\u00f3n puntual central, anillo central blanco aterciopelado y ocho estr\u00edas muy profundas, anillos conc\u00e9ntricos y predomina el color carmelita y sin aspecto micelial. Micelio vegetativo amarillo-blanco-anaranjado con estr\u00eda radial y sin la producci\u00f3n de pigmentos difusibles.<\/p>\n

Por otro lado la cepa A14M7 tiene colonias circulares de bordes ondulados, anillo externo blanco aterciopelado, anillo central aterciopelado de color blanco-verduzco, cuatro estr\u00edas radiales que hacen una depresi\u00f3n central muy profunda dejando una forma de rombo. El micelio vegetativo de color anaranjado-amarillo y zona intermedia anaranjada, no hay producci\u00f3n de pigmentos difusibles. A15M7 presenta colonias circulares con bordes lobulados e inmersos en el medio de cultivo delimitado por una estr\u00eda circular lobulada, colonia elevada hacia el centro en forma de cono con estr\u00edas radiales medianamente profundas, color gris-verdoso. El micelio vegetativo es elevado de color blanco-carmelita con estr\u00edas radiales y sin pigmentos di fusibles.<\/p>\n

La cepa A16M7 revela colonias circulares de color anaranjado, borde entero delimitado por un anillo de color blanco-gris, centro de la colonia con micelio lanoso blanco y vestigios de este tipo de micelio formando un anillo. El micelio vegetativo de color carmelita con bordes m\u00e1s claros y anillo externo m\u00e1s claro, no hay producci\u00f3n de pigmentos di fusibles. La cepa A17M7 tiene colonias circulares con bordes enteros, anillo central y otros conc\u00e9ntricos con micelio aterciopelado de color blanco, predomina una base color carmelita. El micelio vegetativo es de color carmelita con un anillo central carmelita.<\/p>\n

La cepa A18M7 muestra colonias circulares de bordes lobulados y un anillo externo blanco, colonia elevada hacia el centro con un anillo central aterciopelado tupido, estr\u00edas radiales (8) de profundidad media que hacen una depresi\u00f3n central poco profunda, predomina el color blanco. El micelio vegetativo es de color amarillo-blanco, elevado hacia el centro y estr\u00edas radiales, los bordes son m\u00e1s claros. La cepa A19M7 tiene colonias circulares aterciopeladas de color blanco-verdoso, bordes ondulados, una estr\u00eda diametral y otra circular. El micelio vegetativo es de color anaranjado con bordes m\u00e1s claros.<\/p>\n

Al realizar la caracterizaci\u00f3n de las colonias de los actinomicetos aislados a partir de suelo no costero rizosf\u00e9rico de Citrus limon, <\/em>L. en Manzanillo (Figura 6), se pudo observar que la cepa A20M10 muestra colonias circulares con bordes enteros y completamente inmersos en el medio de cultivo, tal que solo emerge la zona central de color carmelita oscuro con muy poca elevaci\u00f3n y aspecto h\u00famedo, muestra vestigios de micelio blanco algodonoso en el centro de la colonia. La cepa A21M10 tiene colonias circulares de bordes enteros, micelio a\u00e9reo algodonoso de color blanco y con el centro m\u00e1s tupido, la colonia a penas se eleva sobre el medio de cultivo. La cepa A25M10 mostr\u00f3 colonias circulares at\u00edpicas con micelio a\u00e9reo blanco y grumoso que forma un anillo externo y uno central. Micelio vegetativo transl\u00facido.<\/p>\n

La cepa A22M12 presenta colonias circulares de<\/p>\n

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bordes lobulados inmersos en el medio de cultivo, base de aspecto cremoso, elevada hacia el centro mostrando una zona central aterciopelada de color blanco y aspecto arrugado-agrietado, aspecto de corteza dura, estr\u00edas radiales que no forman una depresi\u00f3n profunda en el centro. El micelio vegetativo es de color anaranjado con estr\u00edas radiales blancas. La cepa A23M12 tiene colonias circulares de bordes lobulados y levemente inmersos en el medio de cultivo, elevada hacia el centro, estr\u00eda diametral profunda, anillo central estrecho de color blanco, predomina el color carmelita claro. El micelio vegetativo es de color anaranjado con una estr\u00eda diametral blanca. La cepa A24M12 se caracteriza por tener colonias circulares con borde entero y muy levemente inmerso en el medio de cultivo, elevada hacia el centro, predomina el color carmelita oscuro, centro blanco, aterciopelado. En el micelio vegetativo no se observan estr\u00edas ni pigmentos difusibles.<\/p>\n

Colonias similares a las obtenidas en la presente investigaci\u00f3n han sido descritas por Hamdali et al. <\/em>(2012) quienes aislaron y caracterizaron actinobacterias solubilizadoras de fosfato inorg\u00e1nico. 18<\/sup> Tambi\u00e9n Zhang y Zhang (2013) evaluaron seis diferentes medios de cultivos para el aislamiento de actinomicetos, entre los que se encontraban el ACA, medio glicerol-arginina y otros. 19<\/sup> Estos autores obtuvieron una gran diversidad de tipos morfol\u00f3gicos, con caracter\u00edsticas similares a las descritas en la presente investigaci\u00f3n.<\/p>\n

En resumen (Tabla 3), fue posible aislar 25 cepas de actinomicetos tolerantes a la salinidad a partir de suelo rizosf\u00e9rico de diferentes especies vegetales, localizado en la costa sur y en el centro de Granma. La mayor\u00eda de las colonias aisladas mostraron caracter\u00edsticas culturales distintivas; sin embargo, de manera general son circulares, de bordes enteros o lobulados, elevadas hacia el centro y con presencia de estr\u00edas. Casi todas las cepas presentaron colonias de aspecto duro y color blanco en alguna parte de su estructura. Las cepas A3M4, A10M7 y A20M10 mostraron ser muy diferentes al resto dado que crecieron inmersas en el medio de cultivo y solo emergi\u00f3 una parte de la colonia con las estructuras reproductoras, lo cual puede ser indicativo de un bajo requerimiento de ox\u00edgeno (microorganismos microaerof\u00edlico).<\/p>\n

Anexos – Aislamiento, caracterizaci\u00f3n de cepas de actinomicetos<\/strong><\/p>\n