{"id":61197,"date":"2021-03-09T09:43:31","date_gmt":"2021-03-09T08:43:31","guid":{"rendered":"https:\/\/www.revista-portalesmedicos.com\/revista-medica\/?p=61197"},"modified":"2021-03-09T09:43:31","modified_gmt":"2021-03-09T08:43:31","slug":"el-citoesqueleto-de-actina-su-importancia-en-la-formacion-y-mantenimiento-de-los-microambientes-tisulares","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.revista-portalesmedicos.com\/revista-medica\/el-citoesqueleto-de-actina-su-importancia-en-la-formacion-y-mantenimiento-de-los-microambientes-tisulares\/","title":{"rendered":"El citoesqueleto de actina: su importancia en la formaci\u00f3n y mantenimiento de los microambientes tisulares"},"content":{"rendered":"

El citoesqueleto de actina: su importancia en la formaci\u00f3n y mantenimiento de los microambientes tisulares<\/strong><\/p>\n

Autor principal: Julio C\u00e9sar Flores Preciado<\/p>\n

Vol. XVI; n\u00ba 5; 204<\/p>\n

The actin cytoskeleton: its importance in the formation and maintenance of tissue microenvironments<\/strong><\/p>\n

Fecha de recepci\u00f3n: 02\/02\/2021<\/p>\n

Fecha de aceptaci\u00f3n: 05\/03\/2021<\/p>\n

Incluido en Revista Electr\u00f3nica de PortalesMedicos.com Volumen XVI. N\u00famero 5 \u2013\u00a0 Primera quincena de Marzo de 2021 – P\u00e1gina inicial: Vol. XVI; n\u00ba 5; 204\u00a0<\/strong><\/p>\n

Autores: <\/strong><\/p>\n

Julio C\u00e9sar Flores Preciado, Cirujano Dentista, Doctor en Ciencias \u00e1rea biomateriales y biotecnolog\u00eda. Universidad Aut\u00f3noma de Baja California, M\u00e9xico.<\/p>\n

Aaron R\u00edos Rosas, Estudiante de pregrado, Licenciatura en Cirujano Dentista, Universidad Aut\u00f3noma de Baja California, M\u00e9xico.<\/p>\n

RESUMEN<\/strong><\/p>\n

Los microfilamentos de actina del citoesqueleto presentes en las c\u00e9lulas de cultivos obtenidos in vitro les otorgan a estas un dinamismo adaptativo, presentes en el ambiente natural dentro de los tejidos. La c\u00e9lula en el cultivo debe adaptarse y relacionarse exitosamente mediante el correcto manejo de las muestras y la estandarizaci\u00f3n de las t\u00e9cnicas de identificaci\u00f3n, aislamiento y validaci\u00f3n. Para el desarrollo de esta investigaci\u00f3n se realizaron cultivos celulares primarios y secundarios a partir de pulpa dental mediante la t\u00e9cnica de explantes tisulares, cultivados y monitoreados bajo condiciones controladas, enriquecidos y suplementados con medio de cultivo estandarizado y selectivo. Los ensayos de validaci\u00f3n estructural y funcional corresponden a la t\u00e9cnica de inmunomarcaje triple por microscopia confocal giratoria, tanto para la identificaci\u00f3n de c\u00e9lulas mesenquimales como de estructuras intra y extracelulares. Como resultado se obtuvieron c\u00e9lulas mesenquimales activas en su fase de mitosis con una din\u00e1mica de relaci\u00f3n y comunicaci\u00f3n celular adecuada, expresando actividad nuclear y de componentes del citoesqueleto de actina unidireccionales (fibras de estr\u00e9s, c\u00f3rtex y microesp\u00edculas) y multidireccionales (filopodios y lamelipodios) con lo que se confirma el desarrollo de un microambiente celular optimo y se propone el uso de estos complejos celulares \u00a0para el desarrollo de constructos tisulares evaluados en biomodelos como terapia regenerativa en ingenier\u00eda de tejidos.<\/p>\n

PALABRAS CLAVE<\/strong><\/p>\n

andamio, c\u00e9lulas mesenquimales, citoesqueleto, ingenier\u00eda de tejidos, inmunomarcaje.<\/p>\n

ABSTRACT<\/strong><\/p>\n

The actin microfilaments of the cytoskeleton present in cultured cells obtained in vitro give these cells an adaptive dynamism, present in the natural environment within tissues. The cell in culture must adapt and relate successfully through the correct handling of samples and the standardization of identification, isolation, and validation techniques. For the development of this research, primary and secondary cell cultures were performed from dental pulp using the tissue explant technique, cultured and monitored under controlled conditions, enriched and supplemented with standardized and selective culture medium. Structural and functional validation assays correspond to the triple immunolabeling technique by spinning confocal microscopy, both for the identification of mesenchymal cells and intra- and extracellular structures. As a result, active mesenchymal cells were obtained in their mitosis phase with an adequate relationship dynamics and cell communication, expressing nuclear activity and unidirectional (stress fibers, cortex and microspicules) and multidirectional (filopodia and lamellipodia) actin cytoskeleton components, thus confirming the development of an optimal cellular microenvironment and proposing the use of these cell complexes for the development of tissue constructs evaluated in biomodels as regenerative therapy in tissue engineering.<\/p>\n

KEYWORDS<\/strong><\/p>\n

scaffold, mesenchymal cells, cytoskeleton, tissue engineering, immunostaining.<\/p>\n

Los autores de este manuscrito declaran que:<\/p>\n

Todos ellos han participado en su elaboraci\u00f3n y no tienen conflicto de intereses.<\/p>\n

La investigaci\u00f3n se ha realizado siguiendo las Pautas \u00e9ticas internacionales para la investigaci\u00f3n relacionada con la salud con seres humanos elaboradas por el Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ciencias M\u00e9dicas (CIOMS) en colaboraci\u00f3n con la Organizaci\u00f3n Mundial de la Salud (OMS) https:\/\/cioms.ch\/publications\/product\/pautas-eticas-internacionales-para-la-investigacion-relacionada-con-la-salud-con-seres-humanos\/<\/p>\n

El manuscrito es original y no contiene plagio.<\/p>\n

El manuscrito no ha sido publicado en ning\u00fan medio y no est\u00e1 en proceso de revisi\u00f3n en otra revista.<\/p>\n

Han obtenido los permisos necesarios para las im\u00e1genes y gr\u00e1ficos utilizados.<\/p>\n

Han preservado las identidades de los pacientes.<\/p>\n

INTRODUCCI\u00d3N<\/strong><\/p>\n

Con el ambiente apropiado la mayor\u00eda de las c\u00e9lulas vegetales y animales pueden mantenerse, multiplicarse e incluso expresar propiedades diferenciadas en una placa de cultivo. Este m\u00e9todo permite que se puedan observar mediante microscop\u00eda o ser analizados bioqu\u00edmicamente, as\u00ed como comprobar los efectos de a\u00f1adir o retirar diferentes mol\u00e9culas espec\u00edficas, como factores de crecimiento, entre otras posibilidades.<\/p>\n

El cultivo de tejidos data su inicio en 1907, mediante la experimentaci\u00f3n en neurobiolog\u00eda y la denominada hip\u00f3tesis neural, que estableci\u00f3 que cada fibra nerviosa es la prolongaci\u00f3n de una \u00fanica c\u00e9lula nerviosa. La mayor\u00eda de las c\u00e9lulas para tejido tisular requieren de un sustrato s\u00f3lido sobre el cual crecer y dividirse. En la actualidad los cultivos celulares suelen llevarse a cabo sobre placas a las que se adhieren, migran y proliferan. Cuando las c\u00e9lulas se mantienen en cultivo, por regla general conservan su car\u00e1cter original. Cada tipo de c\u00e9lula parece tener una memoria de su desarrollo y estar fija en su forma especializada, aunque pueden suceder algunas transformaciones limitadas.<\/p>\n

La determinaci\u00f3n de la viabilidad de las c\u00e9lulas mantenidas en cultivo constituye un requisito importante antes de que estas c\u00e9lulas puedan se cultivadas in vivo<\/em>. En \u00e9ste sentido, se han descrito diversos m\u00e9todos y t\u00e9cnicas \u00fatiles para la evaluaci\u00f3n de la viabilidad de las c\u00e9lulas, los cuales se pueden utilizar tanto para c\u00e9lulas de crecimiento primario, as\u00ed como tambi\u00e9n a aquellas sometidas a pases sucesivos mediante evaluaciones morfol\u00f3gicas estructurales\u00a0 por medio de t\u00e9cnicas histol\u00f3gicas y de microscop\u00eda \u00f3ptica en ensayos b\u00e1sicos y mediante protocolos de ensayos inmunohistoqu\u00edmicos e inmunomarcaje apoyados con microscop\u00eda especializada confocal y electr\u00f3nica con aplicaciones biol\u00f3gicas.<\/p>\n

El citoesqueleto representa en la c\u00e9lula una red tridimensional de organizaci\u00f3n estructural de soporte y relaci\u00f3n interna y externa.\u00a0 Est\u00e1 conformado por fibras de naturaleza proteica que pueden ser: internas como los microt\u00fabulos (centro-perif\u00e9ricos) y los filamentos intermedios (perif\u00e9rico-centrales) o bien externas como los microfilamentos de actina (corticales o transcelulares), todos ellos con el objetivo principal de establecer relaciones intra y extracelulares mediante la formaci\u00f3n de proyecciones1<\/sup>. El citoesqueleto, mediante los microfilamentos de actina, le brinda a la c\u00e9lula un dinamismo adaptativo, ya sea c\u00e9lula-c\u00e9lula; c\u00e9lula-sustrato, o bien, c\u00e9lula-dispositivo de crecimiento (andamio). Adem\u00e1s, permite el mantenimiento celular brindando su reorganizaci\u00f3n en el cultivo y sobre todo le permite relacionarse o interconectarse facilitando su proliferaci\u00f3n.<\/p>\n

En la mayor\u00eda de los tejidos, el citoesqueleto celular sugiere un andamiaje natural esencial para producir la organizaci\u00f3n celular y en su momento, su regeneraci\u00f3n ordenada. Aunque las c\u00e9lulas aisladas tienen la capacidad para reformar una estructura tisular respectiva, esto lo hacen hasta un punto limitado ya que no tienen organizaci\u00f3n tisular intr\u00ednseca, es decir, con dificultad son capaces de crear un microambiente celular \u00f3ptimo para su crecimiento, desarrollo y reproducci\u00f3n2<\/sup>. Las c\u00e9lulas aisladas no pueden trasplantarse en grandes cantidades ya que existen problemas para la difusi\u00f3n de los nutrientes, con este objetivo se intentan sembrar c\u00e9lulas sobre andamios inertes que sirven de estructura gu\u00eda del desarrollo tisular. En general un andamio est\u00e1 dise\u00f1ado para producir una plantilla estructural para la adhesividad y el desarrollo tisular.<\/p>\n

METODOLOG\u00cdA<\/strong><\/p>\n

Una vez evaluados los crecimientos celulares en los cultivos primarios por microscop\u00eda \u00f3ptica invertida se procedi\u00f3 al desarrollo de la t\u00e9cnica inmunohistoqu\u00edmica por inmunomarcaje triple. Esta t\u00e9cnica permite la identificaci\u00f3n de c\u00e9lulas aisladas positivas al reconocimiento estromal al linaje de c\u00e9lulas mesenquimales, as\u00ed como tambi\u00e9n la identificaci\u00f3n de componentes estructurales intra y extracelulares, la expresi\u00f3n se establece por la reacci\u00f3n ant\u00edgeno-anticuerpo en la que un ant\u00edgeno de superficie membranal presenta una reacci\u00f3n directa e indirecta de un anticuerpo primario policlonal, secundario monoclonal y marcadores o amplificadores de la reacci\u00f3n expresada3<\/sup>.<\/p>\n

T\u00c9CNICA DE INMUNOMARCAJE TRIPLE.<\/strong><\/p>\n

Consisti\u00f3 en la identificaci\u00f3n de c\u00e9lulas aisladas y los diferentes componentes celulares, de manera inicial las clonas celulares se crecieron secundariamente en cajas de 24 pocillos durante 3 d\u00edas, utilizando los siguientes marcadores: anticuerpo primario policlonal STRO-1, anticuerpos secundarios monoclonales, Alexa F594 y Cy5 y los amplificadores fluorescentes vinculina, faloidina y sytox. Posteriormente, se asign\u00f3 a cada pocillo un ensayo inmunohistoqu\u00edmico de acuerdo con los anticuerpos y marcadores suplementados, ver tabla no<\/sup>1: t\u00e9cnica de inmunomarcaje, identificaci\u00f3n de pocillos (al final del art\u00edculo).<\/p>\n

Como primer paso de la inmunohistoqu\u00edmica, se retir\u00f3\u00a0 cuidadosamente por aspiraci\u00f3n el medio de cultivo, realiz\u00e1ndose dos enjuagues con PBS al 1%, continuando con los 3 pasos b\u00e1sicos del marcaje triple: 1) fijaci\u00f3n:<\/em> coloc\u00e1ndose 500 \u00b5L de formalina neutra al 10% , 20 minutos de reposo y doble enjuague con PBS, 2) permeabilizaci\u00f3n:<\/em> colocaci\u00f3n de 500 \u00b5L de Trit\u00f3n 100X al 0.1% en PBS, reposo de 20 minutos y enjuague doble con PBS y, 3) bloqueo:<\/em> adici\u00f3n de 100 \u00b5L de alb\u00famina s\u00e9rica bovina, reposo por 30 minutos para finalmente incubar a 37 o<\/sup>C por 10 minutos. Pasando el tiempo de incubaci\u00f3n se atempero la muestra por 5 minutos retir\u00e1ndose la alb\u00famina con enjuague doble de PBS4<\/sup>.<\/p>\n

Despu\u00e9s del bloqueo, y pasado el segundo enjuague, se coloc\u00f3 el primer anticuerpo en el pozo de control 1, as\u00ed como 200\u00b5L de cada reactivo a los pocillos rotulados, dejando reposar a 4 o<\/sup>C por 12 horas, pasado el tiempo de reposo se enjuag\u00f3 cuidadosamente con PBS en dos ocasiones.<\/p>\n

Posterior al lavado se coloc\u00f3 el segundo anticuerpo en el control 2 y se adicionaron 150 \u00b5L del anticuerpo primario en los pocillos rotulados y adicionados con STRO-1 as\u00ed como 150 \u00b5L del anticuerpo secundario en los pocillos rotulados y adicionados con vinculina, la caja se sell\u00f3 y dejo en reposo por 1 hora a 4 o<\/sup>C. Pasado el tiempo de acci\u00f3n se realiz\u00f3 un enjuague doble con PBS e inici\u00f3 con el an\u00e1lisis de resultados por microscopia confocal giratoria.<\/p>\n

\u00a0<\/strong>RESULTADOS<\/strong><\/p>\n

Reconocimiento estromal.<\/em><\/strong><\/p>\n

Reconocimiento estromal para c\u00e9lulas madre mesenquimales por detecci\u00f3n del marcador espec\u00edfico STRO-1: POSITIVO<\/strong>, ver imagen no<\/sup>1: reconocimiento estromal positivo (al final del art\u00edculo), indicando que las c\u00e9lulas presentes en los cultivos celulares corresponden a clonas de c\u00e9lulas madre derivadas de pulpa dental.<\/p>\n

Reconocimiento estructural.<\/strong><\/p>\n

Se muestran filopodios o microesp\u00edculas y fibras de estr\u00e9s, estructuras transmembranales m\u00faltiples asociadas al citoesqueleto de activa cuyo objetivo es establecer un sistema de interacci\u00f3n, adhesi\u00f3n y organizaci\u00f3n celular (c\u00e9lula-c\u00e9lula)5<\/sup> propias de los mecanismos de comunicaci\u00f3n celular, ver imagen no<\/sup>2: filopodios o microesp\u00edculas y fibras de estr\u00e9s (al final del art\u00edculo).<\/p>\n

Se muestra un complejo asociado de lamelipodios los cuales corresponden a una serie de prolongaciones anchas, transmembranales y multifocales asociadas al citoesqueleto de actina de importancia en las v\u00edas de migraci\u00f3n y organizaci\u00f3n celular (c\u00e9lula-c\u00e9lula) y de soporte de crecimiento tisular (c\u00e9lula-matriz tisular-andamio), ver imagen no<\/sup>3: lamelipodios y proyecciones multifocales6<\/sup> (al final del art\u00edculo). El inter\u00e9s de estas proyecciones radica en que su presencia es de importancia en la creaci\u00f3n de microambientes celulares adaptativos desarrollados de manera natural en el tejido y de forma artificial en los constructos tisulares.<\/p>\n

Se muestra la actividad nuclear, expresando en un corte, la integridad de la membrana y la actividad del contenido gen\u00e9tico, lo que indica el estado de condensaci\u00f3n \u00f3ptimo para iniciar la etapa de replicaci\u00f3n durante el ciclo de divisi\u00f3n celular, ver imagen no<\/sup>4: integridad nuclear (al final del art\u00edculo).<\/p>\n

Se muestra la confluencia del cultivo primario, lo que indica la creaci\u00f3n exitosa de un microambiente celular promotor de v\u00edas de proliferaci\u00f3n, nutrici\u00f3n y comunicaci\u00f3n celular, ver imagen no<\/sup>5: grado de confluencia celular (al final del art\u00edculo).<\/p>\n

Finalmente se observa en un plano tridimensional, grupos de c\u00e9lulas aisladas, expresando con las diferentes estructuras celulares, su \u00edntima relaci\u00f3n, actividad y confluencia, siendo posible establecer que, las c\u00e9lulas madre obtenidas de pulpa dental de dientes permanentes, son c\u00e9lulas estromales o progenitoras con capacidad de adaptaci\u00f3n y proliferaci\u00f3n celular, ver imagen no<\/sup>6: expresi\u00f3n de adaptabilidad y microambiente celular (al final del art\u00edculo).<\/p>\n

CONCLUSIONES<\/strong><\/p>\n

La finalidad del aislamiento y cultivo de los complejos celulares obtenidos a partir de pulpa dental, es la proliferaci\u00f3n de c\u00e9lulas madre mesenquimales a partir de las muestras cultivadas, capaces de originar nuevas c\u00e9lulas, todo ello controlado mediante el perfecto y cuidadoso manejo de los cultivos y subcultivos, as\u00ed como tambi\u00e9n de la t\u00e9cnica empleada y el control del microambiente celular el cual brinda las condiciones id\u00f3neas para la obtenci\u00f3n de cultivos altamente confluentes y con c\u00e9lulas altamente activas. Revisada la informaci\u00f3n obtenida de los diferentes ensayos destacan los siguientes comentarios:<\/p>\n