{"id":72308,"date":"2023-07-10T09:31:33","date_gmt":"2023-07-10T07:31:33","guid":{"rendered":"https:\/\/www.revista-portalesmedicos.com\/revista-medica\/?p=72308"},"modified":"2024-02-23T11:08:07","modified_gmt":"2024-02-23T10:08:07","slug":"crispr-cas9-como-herramienta-de-edicion-genetica-y-sus-aplicaciones-en-la-salud-humana","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.revista-portalesmedicos.com\/revista-medica\/crispr-cas9-como-herramienta-de-edicion-genetica-y-sus-aplicaciones-en-la-salud-humana\/","title":{"rendered":"CRISPR\/Cas9 como herramienta de edici\u00f3n gen\u00e9tica y sus aplicaciones en la salud humana"},"content":{"rendered":"

CRISPR\/Cas9 como herramienta de edici\u00f3n gen\u00e9tica y sus aplicaciones en la salud humana<\/strong><\/p>\n

Autora principal: Dra. Mar\u00eda Jos\u00e9 Alvarado Rubio<\/p>\n

Vol. XVIII; n\u00ba 13; 671<\/p>\n

CRISPR\/Cas9 as a tool for gene editing and human health applications <\/strong><\/p>\n

Fecha de recepci\u00f3n: 06\/06\/2023<\/p>\n

Fecha de aceptaci\u00f3n: 05\/07\/2023<\/p>\n

Incluido en Revista Electr\u00f3nica de PortalesMedicos.com Volumen XVIII. N\u00famero 13 Primera quincena de Julio de 2023 \u2013 P\u00e1gina inicial: Vol. XVIII; n\u00ba 13; 671<\/p>\n

Autores:<\/strong><\/p>\n

Dra. Mar\u00eda Jos\u00e9 Alvarado Rubio1<\/sup>, Dra. Daniela Quesada Arguedas2<\/sup>, Dr. Andr\u00e9s Ram\u00edrez Camacho3<\/sup>, Dr. Fabi\u00e1n S\u00e1nchez Vargas4<\/sup>, Dra. Natalia Villalta Salgado5<\/sup><\/p>\n

1, 2, 3, 4 y 5 M\u00e9dico general, egresados de Escuela Aut\u00f3noma de Ciencias M\u00e9dicas, UCIMED, San Jos\u00e9, Costa Rica.<\/p>\n

Resumen<\/strong><\/p>\n

Los CRISPR-Cas9 se definen seg\u00fan sus siglas como repeticiones palindr\u00f3micas cortas agrupadas y regularmente inter-espaciadas. Son secuencias clave en los sistemas de defensa bacterianos, y forman la base de la terapia gen\u00e9tica conocida como CRISPR \/ Cas9, encargada de cambiar los genes dentro de los organismos.<\/p>\n

Esta tecnolog\u00eda ha revolucionado el mundo de la ingenier\u00eda gen\u00e9tica debido a su capacidad para resolver las limitaciones que presentan otras t\u00e9cnicas de \u00faltima generaci\u00f3n que han sido desarrolladas. Esta singular herramienta de edici\u00f3n gen\u00f3mica perfecciona potencialmente la eficiencia ya que permite reducir el costo de procesamiento, logra introducir o eliminar m\u00e1s de un gen al mismo tiempo sin ser especie-espec\u00edfico, lo que posibilita su uso en pr\u00e1cticamente cualquier organismo.<\/p>\n

Fue a partir de una serie investigaciones desde el 2013 donde fue introducida por primera vez en mam\u00edferos logrando posicionarse como herramienta molecular id\u00f3nea, por lo que en el siguiente trabajo se explicaran sus ventajas, limitaciones y desaf\u00edos identificados hasta hoy. Cabe recalcar que esta t\u00e9cnica experimental no est\u00e1 preparada para aplicarse en humanos, pero se ha desarrollado en diversas c\u00e9lulas vivas y organismos.<\/p>\n

Finalmente, la herramienta de edici\u00f3n del genoma guiada por ARN CRISPR-Cas9 ofrece varias ventajas sobre las dem\u00e1s. Ha demostrado potenciales terap\u00e9uticos en l\u00edneas celulares o modelos animales para enfermedades infecciosas, enfermedades monog\u00e9nicas y c\u00e1ncer. Con el r\u00e1pido avance de esta tecnolog\u00eda, se est\u00e1 logrando revolucionar la investigaci\u00f3n en terapia g\u00e9nica y convertirse en una potencial herramienta para la pr\u00e1ctica de la terapia g\u00e9nica humana.<\/p>\n

Palabras clave<\/strong><\/p>\n

CRISPR\/Cas9, terapia gen\u00e9tica, edici\u00f3n gen\u00f3mica, biolog\u00eda molecular, mutaciones g\u00e9nicas.<\/p>\n

Abstract<\/strong><\/p>\n

CRISPR-Cas9 is defined by its acronym as clustered regularly interspaced short palindromic repeats. They are key sequences in bacterial defense mechanisms and they form the basis of the gene therapy known as CRISPR\/Cas9, which is responsible for changing genes within organisms.<\/p>\n

This technology has revolutionized the world of genetic engineering due to its ability to overcome the limitations of other last generation techniques that have been developed. This unique genomic editing tool potentially improves efficiency by reducing processing cost, managing to introduce or delete more than one gene at the same time without being species-specific, making it possible to use it in virtually any organism.<\/p>\n

It was introduced for the first time in mammals since 2013 from a series of investigations, managing to position itself as an ideal molecular tool. For this reason, the following work will explain its advantages, limitations and challenges it has followed until today. It should be noted that this experimental technique is not ready to be applied in humans, but it has been developed in various living cells and organisms.<\/p>\n

Finally, the CRISPR-Cas9 RNA-guided genome editing tool offers several advantages over the others. It has demonstrated therapeutic potentials in cell lines or animal models for infectious diseases, monogenic diseases, and cancer. With the rapid advancement of this technology, it is succeeding in revolutionizing gene therapy research and becoming a potential tool for the practice of human gene therapy.<\/p>\n

Keywords<\/strong><\/p>\n

CRISPR\/Cas9, gene therapy, genome edition, molecular biology, gene mutations.<\/p>\n

Los autores de este manuscrito declaran que:<\/p>\n

Todos ellos han participado en su elaboraci\u00f3n y no tienen conflictos de intereses
\nLa investigaci\u00f3n se ha realizado siguiendo las Pautas \u00e9ticas internacionales para la investigaci\u00f3n relacionada con la salud con seres humanos elaboradas por el Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ciencias M\u00e9dicas (CIOMS) en colaboraci\u00f3n con la Organizaci\u00f3n Mundial de la Salud (OMS).
\nEl manuscrito es original y no contiene plagio.
\nEl manuscrito no ha sido publicado en ning\u00fan medio y no est\u00e1 en proceso de revisi\u00f3n en otra revista.
\nHan obtenido los permisos necesarios para las im\u00e1genes y gr\u00e1ficos utilizados.
\nHan preservado las identidades de los pacientes.<\/p>\n

Si no incluye toda la informaci\u00f3n arriba indicada se contactar\u00e1 al responsable de la correspondencia del art\u00edculo para que la env\u00ede. El proceso de revisi\u00f3n del trabajo no podr\u00e1 comenzar hasta que dispongamos de ella.<\/p>\n

La informaci\u00f3n que incluya sobre los autores ser\u00e1 eliminada antes de comenzar el proceso de revisi\u00f3n para garantizar el anonimato a lo largo del proceso de arbitraje de los manuscritos.<\/p>\n

Introducci\u00f3n<\/strong><\/p>\n

En la actualidad, la terapia gen\u00e9tica mediante la edici\u00f3n gen\u00f3mica dirigida es uno de los principales campos en los cuales est\u00e1 enfocada la investigaci\u00f3n biom\u00e9dica; cada d\u00eda son m\u00e1s importantes los avances en el estudio de la gen\u00e9tica humana, con el objetivo de desarrollar posibles soluciones a muchas enfermedades y padecimientos definidos por la gen\u00e9tica1<\/sup>. Actualmente se tiene conocimiento de cerca de 10,000 enfermedades hereditarias monog\u00e9nicas, las cuales afectan a millones de personas por todo el planeta; muchas de estas enfermedades son causadas por mutaciones autos\u00f3micas dominantes, es decir que la herencia de una \u00fanica copia defectuosa del gen responsable puede causar s\u00edntomas cl\u00ednicos significativos2<\/sup>. Por eso, es importante el desarrollo de t\u00e9cnicas que permitan editar y corregir el genoma de c\u00e9lulas vivas2<\/sup>.<\/p>\n

El estudio para ampliar y mejorar las terapias g\u00e9nicas actuales, como CRISPR\/cas9 tienen como objetivo ser una soluci\u00f3n moderna, efectiva y segura bas\u00e1ndose en la tecnolog\u00eda \u201cclustered regularly interspaced short palindromic repeats\u201d CRISPR\/Cas9, esta es una herramienta molecular de nucleasas programables utilizada para \u201ceditar\u201d el genoma de cualquier c\u00e9lula1<\/sup>. Se han desarrollado m\u00e1s de 2000 ensayos cl\u00ednicos con el fin de rectificar, reemplazar o eliminar los genes culpables de enfermedades gen\u00e9ticas e inducir mutaciones terap\u00e9uticas o protectoras3<\/sup>. Esta herramienta ofrece varias ventajas sobre las convencionales como dise\u00f1o simple y facilidad de uso3<\/sup>. Por lo tanto, se postula como una futura herramienta rentable y conveniente para diversos fines de edici\u00f3n del genoma como: la correcci\u00f3n de variantes causantes de enfermedades monog\u00e9nicas, medicina regenerativa y la mejora de la terapia con c\u00e9lulas T4<\/sup>.<\/p>\n

A pesar de que los inicios de la edici\u00f3n gen\u00f3mica dirigida datan del a\u00f1o 1970 y que los avances y descubrimientos actuales parecen tener potencial para desarrollar terapias efectivas, existen a\u00fan muchas limitaciones para la aplicaci\u00f3n de estas terapias en humanos, ya que su mecanismo es muy complejo y no garantiza resultados efectivos en todos los casos, as\u00ed como la edici\u00f3n del ADN en c\u00e9lulas no deseadas lo cual constituye la principal limitaci\u00f3n, ya que podr\u00eda tener implicaciones sumamente graves e incluso mortales en quienes se sometan a la terapia5<\/sup>.\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 <\/sup><\/p>\n

A partir de esta revisi\u00f3n se pretende analizar el CRISPR\/Cas9 y explicar su mecanismo de acci\u00f3n para entender correctamente su funci\u00f3n como herramienta de edici\u00f3n gen\u00e9tica1<\/sup>. Adem\u00e1s, mencionar sus aplicaciones potenciales en terapia celular y gen\u00e9tica, as\u00ed como tambi\u00e9n sus repercusiones en la salud humana1<\/sup>.<\/p>\n

Historia<\/strong><\/p>\n

Como parte de la historia, en el a\u00f1o 1987 se public\u00f3 el primer art\u00edculo acerca de secuencias repetidas en el genoma de las bacterias, como E. coli y S. pyogenes<\/em>.6<\/sup> Inicialmente se pens\u00f3 que estas secuencias repetidas carec\u00edan de funci\u00f3n6<\/sup>. Sin embargo, en el a\u00f1o de 1993, Francisco Mart\u00ednez Mojica de origen espa\u00f1ol, describi\u00f3 secuencias similares en las bacterias Haloferax mediterranei<\/em> y otros tipos de bacterias, por lo que decidi\u00f3 llamarlas \u201cshort regularly spaced repeats\u201d (SRSRs)7<\/sup>. Dos a\u00f1os despu\u00e9s, Ruud Jansen encontr\u00f3 genes asociados a estas secuencias repetidas y con la aprobaci\u00f3n de Mojica, renombraron las secuencias a \u201cclustered regularly interspaced short palindromic repeats\u201d (CRISPR)7<\/sup>.<\/p>\n

Las similitudes entre los espaciadores asociados a CRISPR y el material gen\u00e9tico de ciertos virus que invaden bacterias, fueron identificadas en el a\u00f1o 2005 por Mart\u00ednez Mojica; fue en ese momento cuando se reconoce el sistema CRISPR como un sistema de defensa de las bacterias.6<\/sup> Este descubrimiento es la base actual del\u00a0 desarrollo de la t\u00e9cnica de edici\u00f3n gen\u00e9tica. En el 2012, se realiz\u00f3 un primer \u201ccorte\u201d con el sistema CRISPR\/Cas9 en un tubo de ensayo, por el equipo liderado por Doudna y Charpentier, quienes supusieron que lo mismo se podr\u00eda realizar en c\u00e9lulas eucariotas y ser utilizado para edici\u00f3n gen\u00e9tica6<\/sup>. En el mismo a\u00f1o, Feng Zhang realiza el primer corte con CRISPR\/Cas9 sobre el genoma de una c\u00e9lula de mam\u00edfero6<\/sup>.<\/p>\n

Mecanismo de Acci\u00f3n<\/strong><\/p>\n

El sistema CRISPR\/Cas9 tiene dos componentes: un ARN proveniente de la secuencia CRISPR, llamado \u201cARNcr\u201d y la endonucleasa Cas8<\/sup>. El ARNcr se obtiene de la actividad del mecanismo de defensa de las bacterias, es decir, el sistema CRISPR8<\/sup>. Est\u00e1 compuesto por secuencias repetitivas palindr\u00f3micas separadas entre s\u00ed mediante secuencias denominadas \u201cespaciadores\u201d y por delante, una secuencia llamada l\u00edder o promotor.1 <\/sup>Cerca de este agrupamiento, se encuentran genes que codifican para un tipo de nucleasas llamados genes CAS<\/em> (CRISPR associated proteins)8<\/sup>. Dichos componentes se muestran en la figura 19<\/sup>.<\/p>\n

Cuando una bacteria es invadida por un pat\u00f3geno, lo primero que ocurre es que los genes CAS<\/em> forman un complejo proteico llamado Cas9 que puede transcribir el ADN de las secuencias CRISPR en ARN, a este se le llama \u201cARNcr\u201d1<\/sup>. El complejo, al entrar en contacto con el material gen\u00e9tico del pat\u00f3geno, destruye al virus8<\/sup>. Adem\u00e1s, \u00e9stas prote\u00ednas Cas son capaces de \u201ccortar\u201d una peque\u00f1a parte del ADN pat\u00f3geno con ayuda tanto del ARNcr, que lo gu\u00eda hacia la cadena complementaria que debe cortar; y las secuencias PAM (protospacer adjacent motif) que son las secuencias que se encuentran junto al punto de corte, capaces de distinguir el ADN bacteriano del ADN invasor8<\/sup>. Posteriormente, este fragmento es incorporado dentro del conjunto de secuencias CRISPR; de esta forma, si la bacteria vuelve a entrar en contacto con el pat\u00f3geno, \u00e9sta es capaz de reconocer a las mol\u00e9culas de ADN pat\u00f3geno y de guiar a la nucleasa Cas9 para que realice el corte para luego eliminarlas10<\/sup>. Este mecanismo de defensa bacteriano se observa en la figura 21<\/sup>.<\/p>\n

La capacidad para reprogramar el sistema CRISPR fue desarrollada por Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier y es lo que ha dado lugar a una gran variedad de opciones de potenciales aplicaciones en la edici\u00f3n gen\u00e9tica10<\/sup>. Actualmente existen descritos tres diferentes tipos de CRISPR, el I, II y III1<\/sup>. El tipo II es el m\u00e1s estudiado y empleado universalmente1<\/sup>. En este, la endonucleasa Cas<\/em> se asocia con el ARNcr y forma el complejo CRISPR\/Cas, que como se mencion\u00f3 previamente es el que gu\u00eda la nucleasa1<\/sup>. Entonces para la edici\u00f3n g\u00e9nica, lo que se hace es que \u201creprograman\u201d el ARNcr modificando as\u00ed el objetivo diana de la nucleasa10<\/sup>; para esto, se debe mantener intacta toda la estructura a excepci\u00f3n de los 20-30 nucle\u00f3tidos que forman la secuencia espaciadora10<\/sup>. Posteriormente, para que el CRISPR sea espec\u00edfico, se debe tener una completa complementariedad entre los nucle\u00f3tidos de la secuencia espaciadora y el ADN diana, ya que con una tan sola diferencia que se presente, el sistema no funcionar\u00e111<\/sup>. Adem\u00e1s de esta homolog\u00eda, es esencial el reconocimiento de la secuencia PAM por la nucleasa, ya que de esta manera se une, empareja las bases y produce el corte en el ADN de inter\u00e9s 8<\/sup>.<\/p>\n

Esta precisi\u00f3n de cortes sitio-espec\u00edfico ha permitido al CRISPR\/Cas adaptarse para insertar, eliminar o generar mutaciones en diferentes secuencias1<\/sup>. Dichas mutaciones pueden ser por medio de la inserci\u00f3n de genes por recombinaci\u00f3n hom\u00f3loga, por deleciones dentro del genoma y por mutag\u00e9nesis1<\/sup>. La inserci\u00f3n de genes por recombinaci\u00f3n hom\u00f3loga consiste en el corte por medio de la nucleasa y posteriormente la inserci\u00f3n de una secuencia con alta homolog\u00eda por los extremos 3\u2019 y 5\u2019, con esto el CRISPR\/Cas puede dirigirse hacia un locus del genoma en c\u00e9lulas humanas e inducir una reparaci\u00f3n con una baja tasa de mutag\u00e9nesis1<\/sup>. En la deleci\u00f3n dentro del genoma, se realiza el corte por medio de la nucleasa y se generan deleciones de fragmentos grandes en ADN de doble cadena1<\/sup>. Finalmente, en la mutag\u00e9nesis, se reprograma el ARNcr para una o varias secuencias espec\u00edficas y con esto, se logra inducir mutag\u00e9nesis en genes objetivo hasta con una eficiencia del 88%1<\/sup>.<\/p>\n

Luego, estos cortes generados por la nucleasa, activan en el genoma la reparaci\u00f3n mediante una reparaci\u00f3n dirigida hom\u00f3loga (HDR) o mediante un reparaci\u00f3n final no hom\u00f3loga (NHEJ)4<\/sup>. La v\u00eda de reparaci\u00f3n preferencial es la NHEJ, cuyo mecanismo consiste en la uni\u00f3n de los extremos rotos, sin la necesidad de un molde hom\u00f3logo4<\/sup>. Sin embargo, a pesar de esta ruta ser precisa, t\u00edpicamente puede crear errores, ya que puede introducir mutaciones adicionales al generar inserciones o deleciones en la zona de la uni\u00f3n4<\/sup>. Por otro lado, en la reparaci\u00f3n que es la recombinaci\u00f3n hom\u00f3loga (HDR), se introduce un molde de ADN en la c\u00e9lula4<\/sup>. Esta v\u00eda puede utilizar como molde la regi\u00f3n correspondiente del cromosoma hom\u00f3logo o una mol\u00e9cula ex\u00f3gena de ADN provista para llevar a cabo la correcta uni\u00f3n de los extremos, ambos procesos de reparaci\u00f3n se pueden visualizar claramente en la figura 34,1<\/sup>. En resumidas cuentas, la diferencia entre el HDR y NHEJ es que el primero conduce a una correcci\u00f3n o reemplazo g\u00e9nico preciso, mientras que NHEJ es propenso a errores y puede terminar insertando o eliminando mutaciones4<\/sup>.<\/p>\n

Aplicaciones\u00a0 <\/strong><\/p>\n

Algunas de las aplicaciones que tiene la herramienta de edici\u00f3n del genoma CRISPR incluye la edici\u00f3n g\u00e9nica en protozoos, hongos, plantas, animales (mam\u00edferos) y humanos5<\/sup>. \u201cLa correcci\u00f3n de los trastornos monog\u00e9nicos representa el campo m\u00e1s importante en la terapia g\u00e9nica mediada por CRISPR-Cas9\u201d5<\/sup>. Por ejemplo, en el modelo de rat\u00f3n de distrofia muscular de Duchenne (enfermedad monog\u00e9nica ligada a X heredada) la cual se basa en una mutaci\u00f3n en el gen DMD y la correcci\u00f3n de cataratas en murinos por el gen Crygc4<\/sup><\/em>.<\/p>\n

Las c\u00e9lulas madre pluripotentes inducidas (iPSC) pueden modificarse gen\u00e9ticamente in vitro con esta herramienta, para luego diferenciarse en c\u00e9lulas deseadas por ejemplo en pacientes con \u03b2-talasemia3,5<\/sup> y pacientes con distrofia muscular de Duchenne4<\/sup>.<\/p>\n

La inactivaci\u00f3n o eliminaci\u00f3n del virus oncog\u00e9nico se logra porque esta herramienta se deriva del sistema inmune nativo bacteriano. Por ejemplo, con el VIH, el CRISPR-Cas9 al mutar los tejidos som\u00e1ticos, el gen CCR5<\/em> (receptor 5 de quimiocina CC) conduce a la resistencia celular a la infecci\u00f3n; con la transfecci\u00f3n de Cas9 y sgRNAs dirigidos a HPV16 y gen Lacl <\/em>se logra reducir la carga viral de c\u00e9lulas cancerosas de c\u00e9rvix, Linfoma de Burkitt y c\u00e1ncer de vejiga respectivamente4<\/sup>. Por lo tanto, se puede afirmar que\u00a0 las aplicaciones de esta herramienta est\u00e1n revolucionando la agricultura, biolog\u00eda, la biotecnolog\u00eda y la medicina5<\/sup>.<\/p>\n

Desaf\u00edos, limitantes y posibles soluciones en terapia g\u00e9nica <\/strong><\/p>\n

Si bien el sistema CRISPR\/Cas9 se postula como una potencial opci\u00f3n de terapia gen\u00e9tica la cual revolucionar\u00eda la medicina y muchos beneficios, tambi\u00e9n existen desaf\u00edos como la inmunogenicidad, la especificidad y eficacia en la edici\u00f3n gen\u00f3mica terap\u00e9utica, ya que son una limitante en la aplicaci\u00f3n de este tipo de terapia en personas debido a que sus consecuencias podr\u00edan ser mayores que sus beneficios.12<\/sup> Estos desaf\u00edos se traducen espec\u00edficamente en efectos fuera de c\u00e9lulas objetivo, ya que una secuencia espec\u00edfica que se quiera modificar puede estar presente en c\u00e9lulas de otros tejidos no objetivo1,2<\/sup>.<\/p>\n

Por eso es necesario encontrar m\u00e9todos los cuales permitan identificar y caracterizar de manera m\u00e1s completa, los mecanismos y elementos involucrados en la ocurrencia de efectos fuera de objetivo, como podr\u00eda ser la uni\u00f3n del Cas 9 a secuencias de ADN equivocadas o la escisi\u00f3n err\u00f3nea de segmentos de ADN, donde puede tener influencia la existencia de similitud entre secuencias.4 <\/sup>\u00a0Debido a esto se requieren m\u00e9todos que permitan mejorar la precisi\u00f3n de este sistema como por ejemplo definir y caracterizar el perfil de uni\u00f3n del Cas9 al genoma y c\u00f3mo interacciona con este y sus distintos componentes, lo cual se encuentra en constante estudio e investigaci\u00f3n.4 <\/sup><\/p>\n

Actualmente algunos de los m\u00e9todos desarrollados con el fin de reducir los efectos fuera del objetivo son: la selecci\u00f3n de un sitio objetivo que no tenga una secuencia hom\u00f3loga en el genoma, donde cobra importancia la composici\u00f3n y estructura del ARN gu\u00eda, el uso de pares de Cas9 nickases, una forma mutada de Cas9 la cual en vez de generar una ruptura de doble filamento, genera una ruptura monocatenaria, lo que aumenta la especificidad del objetivo, utilizar sgRNA fragmentado en 2-3 pares de bases tambi\u00e9n puede reducir los efectos fuera de objetivo que al ser m\u00e1s corta tiene una tolerancia de desajuste disminuida, usar veh\u00edculos de transporte intracelular del CRISPR-Cas9 como el p\u00e9ptido de penetraci\u00f3n, que demostr\u00f3 mayor precisi\u00f3n en comparaci\u00f3n con el suministro mediado por pl\u00e1smido y por \u00faltimo realizar una combinaci\u00f3n de CRISPR-Cas9 con otra nucleasa como FokI4<\/sup>.<\/p>\n

Con el fin de evitar la edici\u00f3n permanente de genes en tejidos no objetivo, se ha desarrollado una posible alternativa que permite terminar con la actividad enzim\u00e1tica de Cas9 una vez completada la modificaci\u00f3n terap\u00e9utica del ADN deseada, a trav\u00e9s la administraci\u00f3n de un anti oligonucle\u00f3tido Cas9 universal que tiene como blanco el sgRNA, capaz de inactivar todas las ribonucleoprote\u00ednas CRISPR-Cas9 y los diferentes componentes que forman parte del complejo; el cual tambi\u00e9n se podr\u00eda utilizar de manera profil\u00e1ctica mediante la pre administraci\u00f3n de este anti oligonucle\u00f3tido selectivamente en tejidos no objetivo y de esta forma evitar la actividad enzim\u00e1tica Cas9 y la edici\u00f3n de ADN en estos tejidos no objetivo13<\/sup>. Esto busca incrementar la seguridad y posibilidad de aplicaci\u00f3n cl\u00ednica de la edici\u00f3n de genes mediante CRISPR-Cas9 en personas, acabando con las barreras actuales13<\/sup>. Los mecanismos en los cuales se basa este tipo de terapia se ejemplifican en la figura 4.13<\/sup><\/p>\n

Otras Terapias G\u00e9nicas <\/strong><\/p>\n

Existen otros tipos de terapia g\u00e9nica a parte de la CRISPR\/Cas9, estas pueden ser de diferentes tipos. La terapia con oligonucle\u00f3tidos, hace referencia a oligonucle\u00f3tidos terap\u00e9uticos que son 15-30 nucle\u00f3tidos de largo y est\u00e1 dise\u00f1ados para complementar a una regi\u00f3n espec\u00edfica del ARNm, que codifica a una prote\u00edna relacionada con una enfermedad o un ARN regulador e identifica las secuencias que son altamente espec\u00edficas para ese ARN espec\u00edfico14<\/sup>. La terapia ex vivo trata de aislar las c\u00e9lulas afectadas, cultivarlas in vitro <\/em>en un laboratorio y someterlas al proceso de transducci\u00f3n g\u00e9nica; una vez transformadas las c\u00e9lulas, se vuelven a reimplantar al individuo donante15<\/sup>. Su ventaja es que solo se exponen a la transferencia del gen terap\u00e9utico las c\u00e9lulas afectadas15<\/sup>. Ejemplos: Inmunodeficiencias combinadas graves: deficiencia de adenosina desaminasa (ADA), una enfermedad que generalmente es mortal en la primera infancia, Talasemias y anemia por c\u00e9lulas16<\/sup>. Por \u00faltimo, la terapia In vivo consiste en introducir el vector con el gen terap\u00e9utico directamente al paciente, ya sea por v\u00eda sist\u00e9mica (en infusi\u00f3n), o por inyecci\u00f3n directa en el tejido afectado, tal y como se muestra en la figura 516<\/sup>. El problema es que no se logra aislar \u00fanicamente en las c\u00e9lulas deseadas16<\/sup>.\u00a0 Ejemplos: El tratamiento de una forma rara de ceguera autos\u00f3mica recesiva causada por mutaciones en RPE65<\/em>, que codifica una enzima cr\u00edtica para el ciclo visual.15<\/sup> Hemofilia, especialmente la B y Atrofia Muscular Espinal16<\/sup>.<\/p>\n

Conclusi\u00f3n<\/strong><\/p>\n

Finalmente, se puede decir que el desarrollo del sistema CRISPR a partir de 1987 ha sido de gran utilidad para la terapia g\u00e9nica. Cabe recalcar que su descubrimiento no fue tan certero debido a que el primer art\u00edculo que se public\u00f3 s\u00f3lo explicaba las secuencias repetidas en el genoma de las bacterias, como E. coli y S. pyogenes<\/em> y fue Mojica en 1993 el encargado de definir a estas secuencias como \u201cshort regularly spaced repeats\u201d (SRSRs) y es en el a\u00f1o 2013 donde se introdujo por primera vez en organismo mam\u00edferos.<\/p>\n

Por otro lado, el mecanismo de edici\u00f3n gen\u00f3mica con CRISPR-Cas9, consiste en una etapa inicial, en donde el ARN gu\u00eda (sgRNA), es el encargado de dirigir a la endonucleasa Cas9 a cortar el ADN en una regi\u00f3n espec\u00edfica seguido de la activaci\u00f3n de mecanismos de reparaci\u00f3n (mutaciones de inserci\u00f3n o deleci\u00f3n). Sin este proceso mencionado anteriormente, no se podr\u00eda realizar el recambio de genes en cualquier organismo envuelto en esta t\u00e9cnica.<\/p>\n

Este sistema es una herramienta de edici\u00f3n vers\u00e1til, capaz de corregir mutaciones gen\u00e9ticas como se demostr\u00f3 en enfermedades monog\u00e9nicas y modular estados epigen\u00e9ticos. En la actualidad, se aplica en inmunizaci\u00f3n artificial contra fagos en bacterias y en el estudio del genoma dirigido por ARN. Tambi\u00e9n se ha utilizado en varios ensayos cl\u00ednicos como el de combinaciones de terapia antiretroviral y eliminaci\u00f3n del VIH en ratones vivos; en la supresi\u00f3n de la distrofia muscular; el desarrollo de c\u00e9lulas madre pluripotentes no detectables por el sistema inmunitario, terapia contra el c\u00e1ncer, entre otras. Existen otras terapias g\u00e9nicas involucradas en la edici\u00f3n del genoma como los vectores en terapia g\u00e9nica como el virus adenoasociados (AVV), cromosomas artificiales, m\u00e9todos no virales como oligonucleotidos entre otros.<\/p>\n

Si se tuviera que escoger una sola t\u00e9cnica de entre todas las desarrolladas, sin lugar a dudas se escoger\u00eda CRISPR\/Cas9. El impacto cient\u00edfico que ha logrado hoy en d\u00eda es incuestionable y seguir\u00e1 aumentando debido a la mejora continua que se pretende realizar en ella. Parte de la comunidad cient\u00edfica que trabaja con el CRISPR\/Cas9 desea colocarla como una tecnolog\u00eda altamente precisa y eficaz en el campo cl\u00ednico y biotecnol\u00f3gico.<\/p>\n

Ver anexo<\/strong><\/a><\/p>\n

Referencias<\/strong><\/p>\n

    \n
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