{"id":77418,"date":"2024-07-15T08:53:30","date_gmt":"2024-07-15T06:53:30","guid":{"rendered":"https:\/\/www.revista-portalesmedicos.com\/revista-medica\/?p=77418"},"modified":"2024-07-11T09:51:26","modified_gmt":"2024-07-11T07:51:26","slug":"herramienta-de-edicion-genica-crispr-cas-su-papel-en-la-terapia-genica-y-su-potencial-terapeutico-para-la-distrofia-muscular-de-duchenne","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.revista-portalesmedicos.com\/revista-medica\/herramienta-de-edicion-genica-crispr-cas-su-papel-en-la-terapia-genica-y-su-potencial-terapeutico-para-la-distrofia-muscular-de-duchenne\/","title":{"rendered":"Herramienta de edicio\u0301n ge\u0301nica CRISPR\/Cas: su papel en la terapia ge\u0301nica y su potencial terape\u0301utico para la Distrofia Muscular de Duchenne"},"content":{"rendered":"

Herramienta de edicio\u0301n ge\u0301nica CRISPR\/Cas: su papel en la terapia ge\u0301nica y su potencial terape\u0301utico para la Distrofia Muscular de Duchenne<\/strong><\/p>\n

Autora principal: Mar\u00eda Paz Alfaro Chan<\/p>\n

Vol. XIX; n\u00ba 13; 417<\/p>\n

CRISPR\/Cas gene editing tool: its role in gene therapy and its therapeutic potential for Duchenne Muscular Dystrophy<\/strong><\/p>\n

Fecha de recepci\u00f3n: 16\/06\/2024<\/p>\n

Fecha de aceptaci\u00f3n: 11\/07\/2024<\/p>\n

Incluido en Revista Electr\u00f3nica de PortalesMedicos.com Volumen XIX. N\u00famero 13 Primera quincena de Julio de 2024 \u2013 P\u00e1gina inicial: Vol. XIX; n\u00ba 13; 417<\/p>\n

Autores:<\/strong><\/p>\n

Mar\u00eda Paz Alfaro Chan 1<\/sup>, Daniel Ruiz Mairena 2<\/sup>, David Alvarado Chou 3<\/sup>, Mar\u00eda Jos\u00e9 Mora Navarro 4<\/sup>, Ignacio Jos\u00e9 Silesky Valverde 5<\/sup>, Jos\u00e9 Pablo Gonz\u00e1lez Aguilar 6<\/sup>, Andr\u00e9s Astorga Sosa 7<\/sup> \u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 <\/strong><\/p>\n

    \n
  1. Mar\u00eda Paz Alfaro Chan. Me\u0301dico General, Investigadora Independiente, San Jose\u0301, Costa Rica. https:\/\/orcid.org\/0000-0001-9617-1389<\/a><\/li>\n
  2. Daniel Ruiz Mairena. Me\u0301dico General, Investigador Independiente, San Jose\u0301, Costa Rica. https:\/\/orcid.org\/0000-0002-5215-6096<\/a><\/li>\n
  3. David Alvarado Chou. Me\u0301dico General, Investigador Independiente, San Jose\u0301, Costa Rica. https:\/\/orcid.org\/0000-0001-8471-1202<\/a><\/li>\n
  4. Mar\u00eda Jose\u0301 Mora Navarro. Me\u0301dico General, Investigadora Independiente, San Jose\u0301, Costa Rica. https:\/\/orcid.org\/0009-0002-4499-971X<\/a><\/li>\n
  5. Ignacio Jose\u0301 Silesky Valverde. Me\u0301dico General, Investigador Independiente, San Jose\u0301, Costa Rica. https:\/\/orcid.org\/0009-0004-7432-0549<\/a><\/li>\n
  6. Jos\u00e9\u00a0 Pablo Gonz\u00e1lez Aguilar. Me\u0301dico General, Investigador Independiente, San Jose\u0301, Costa Rica. https:\/\/orcid.org\/0000-0002-0055-8763<\/a><\/li>\n
  7. Andre\u0301s Astorga Sosa. Me\u0301dico General, Investigador Independiente, San Jose\u0301, Costa Rica. https:\/\/orcid.org\/0000-0001-9120-193X<\/a><\/li>\n<\/ol>\n

    Resumen<\/strong><\/p>\n

    Uno de los principales objetivos de las investigaciones actuales en el a\u0301mbito de la gene\u0301tica, se centra en el desarrollo de te\u0301cnicas que permitan editar o corregir con precisio\u0301n y eficiencia el genoma de ce\u0301lulas vivas. Entre las distintas herramientas de edicio\u0301n geno\u0301mica que han surgido, se destaca el sistema CRISPR\/Cas9, un mecanismo de defensa bacteriano que ha sido adaptado y redisen\u0303ado para su utilizacio\u0301n en otros modelos celulares. La Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) es una de las enfermedades que ha sido foco de investigacio\u0301n, donde en experimentos recientes con CRISPR\/Cas9, se han logrado reducir genes que codifican para la funcio\u0301n del gen DMD<\/em>. A pesar de los mu\u0301ltiples avances de esta te\u0301cnica de edicio\u0301n gene\u0301tica, au\u0301n se requiere incrementar su especificidad para eliminar la aparicio\u0301n de mutaciones fuera del gen objetivo.<\/p>\n

    Palabras clave: <\/strong>CRISPR\/Cas, Edicio\u0301n geno\u0301mica, Terapia ge\u0301nica, Distrofia Muscular de Duchenne.<\/p>\n

    Siglas: <\/strong>DMD: Distrofia Muscular de Duchenne, CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, DSB: Doble cadena de ADN de extremos romos, NHEJ: Unio\u0301n de extremos no homo\u0301logos, PAM: Motivo adyacente de protoespaciador, AAV: virus adeno asociado, vegrfr2: <\/em>receptor tipo 2 de factor de crecimiento endotelial vascular, CFTR: regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis qui\u0301stica.<\/p>\n

    Abstract<\/strong><\/p>\n

    One of the main objectives of current research in the field of genetics focuses on the development of techniques that allow the genome of living cells to be edited or corrected with precision and efficiency. Among the different genome editing tools that have emerged, the CRISPR\/Cas9 system stands out, a bacterial defense mechanism that has been adapted and redesigned for use in other cell models. Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is one of the diseases that has been the focus of research, where in recent experiments with CRISPR\/Cas9, genes that encode the function of the DMD gene have been reduced. Despite the multiple advances of this gene editing technique, its specificity still needs to be increased to eliminate the appearance of mutations outside the target gene.<\/p>\n

    Keywords<\/strong><\/p>\n

    CRISPR\/Cas, Genome editing, Gene therapy, Duchenne Muscular Dystrophy.<\/p>\n

    Declaraci\u00f3n de buenas pr\u00e1cticas cl\u00ednicas<\/strong><\/p>\n

    Los autores de este manuscrito declaran que: Todos ellos han participado en su elaboraci\u00f3n y no tienen conflictos de intereses. La investigaci\u00f3n se ha realizado siguiendo las pautas \u00e9ticas internacionales para la investigaci\u00f3n relacionada con la salud con seres humanos elaboradas por el Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ciencias M\u00e9dicas (CIOMS) en colaboraci\u00f3n con la Organizaci\u00f3n Mundial de la Salud (OMS). El manuscrito es original y no contiene plagio. El manuscrito no ha sido publicado en ning\u00fan medio y no est\u00e1 en proceso de revisi\u00f3n en otra revista. Han obtenido los permisos necesarios para las im\u00e1genes y gr\u00e1ficos utilizados. Han preservado las identidades de los pacientes<\/p>\n

    Introducci\u00f3n<\/strong><\/p>\n

    A partir de la propuesta del modelo tridimensional de la doble he\u0301lice por Watson y Crick en 1953, se dio el punto de partida para el desarrollo de mu\u0301ltiples te\u0301cnicas para la manipulacio\u0301n del material gene\u0301tico, su modificacio\u0301n y expresio\u0301n.1 2\u00a0 <\/sup>La terapia ge\u0301nica es una de estas te\u0301cnicas, la cual se entiende como el tratamiento de enfermedades hereditarias o adquiridas mediante la transferencia de material gene\u0301tico en ce\u0301lulas del paciente con la finalidad de restablecer una funcio\u0301n celular que estaba defectuosa, introducir una nueva funcio\u0301n o interferir con una funcio\u0301n existente. 1<\/sup><\/p>\n

    Una de las te\u0301cnicas moleculares que han tenido mayor impacto en los u\u0301ltimos an\u0303os es la herramienta molecular conocida como CRISPR \/ Cas9.1<\/sup> CRISPR es la sigla inglesa para \u201cClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats\u201d, que en espan\u0303ol significa repeticiones palindro\u0301micas cortas, agrupadas y regularmente interespaciadas.3\u00a0 <\/sup>Estas siglas son el nombre que recibe un locus (locus = posicio\u0301n del gen u otra secuencia de ADN) del cromosoma bacteriano en donde se encuentran genes, con los cuales se ha creado una poderosa herramienta que permite manipular deliberadamente el ADN de cualquier organismo.4<\/sup><\/p>\n

    En la actualidad este sistema se utiliza para cortar zonas de intere\u0301s del ADN e introducir secuencias deseadas que produciri\u0301an genotipos o fenotipos deseados.4<\/sup> A diferencia de otras te\u0301cnicas, esta permite la edicio\u0301n de forma tan especi\u0301fica de secuencias del ADN del genoma que se podri\u0301a hacer la comparacio\u0301n a unas \u201ctijeras moleculares\u201d que cortan en puntos determinados e insertan los cambios con exactitud.1<\/sup> En el campo de la gene\u0301tica me\u0301dica ha sido de gran relevancia, en especial en enfermedades gene\u0301ticas como lo es la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD).5<\/sup><\/p>\n

    Hasta la fecha, no existe una cura definitiva para las distrofias musculares, sin embargo, se han desarrollado diferentes tratamientos para mejorar los si\u0301ntomas de la enfermedad.5 6<\/sup> Entre estos encontramos terapias de expresio\u0301n ge\u0301nica y terapias de reemplazo de genes. Lo anterior se logra al apuntar estrate\u0301gicamente ciertas secuencias de gen DMD <\/em>para editar, las secuencias de corte y empalme se pueden alterar o interrumpir para omitir exones. 5<\/sup> Esta revisio\u0301n resume los estudios y avances recientes en el campo de la terapia ge\u0301nica que han empleado el sistema CRISPR \/ Cas9 para el posible tratamiento de la DMD. Dado lo anterior, el objetivo de esta revisio\u0301n se centra en difundir la importancia de este mecanismo en el campo de la medicina con un enfoque principal en los estudios sobre DMD.<\/p>\n

    Sistema CRISPR\/Cas \u00bfCo\u0301mo Funciona?<\/strong><\/p>\n

    La edicio\u0301n del gen CRISPR \/ Cas9 se adapto\u0301 a partir de los mecanismos endo\u0301genos de la inmunidad adaptativa bacteriana contra la infeccio\u0301n viral.7<\/sup> Estas bacteria poseen locus CRISPR que contienen tres elementos ba\u0301sicos: la matriz CRISPR, el gen de la enzima Cas9 y el gen tracrRNA (ARN CRISPR trans-activador). La matriz CRISPR se compone de elementos espaciadores y repetidos intercalados entre si\u0301. Los elementos espaciadores se derivan de fragmentos de ADN viral extran\u0303o que, por ejemplo, procesa una bacteria tras una infeccio\u0301n. 5 8<\/sup><\/p>\n

    La transcripcio\u0301n de esta matriz produce ARN pre-CRISPR (pre-crRNA), que luego se hibridan con los tracrRNA producidos a partir de los mismos loci mediante el emparejamiento de bases en los elementos repetidos. Esto inicia el procesamiento enzima\u0301tico y la maduracio\u0301n de los pre-crRNA en crRNAs.3 4<\/sup> Estos hi\u0301bridos tracrRNA-crRNA ahora pueden ser reconocidos y unidos por Cas9, una endonucleasa que induce roturas de doble cadena de ADN de extremos romos (DSB) (ver Figura 1).3<\/sup> Seguidamente, Cas9 se gui\u0301a a su objetivo, una secuencia de 20 nucleo\u0301tidos que debe estar junto a una secuencia de motivo adyacente protoespaciador (PAM), en virtud de la complementariedad con el crRNA que porta.3 4<\/sup> Por tanto, Cas9 es una endonucleasa de ADN guiada por ARN. De esta manera, el ADN extran\u0303o procedente de virus infecciosos se degrada eficazmente, evitando el avance de la infeccio\u0301n.4<\/sup><\/p>\n

    Con la informacio\u0301n anterior, es ma\u0301s fa\u0301cil visualizar co\u0301mo se puede adaptar el sistema CRISPR \/ Cas9 para su uso en la edicio\u0301n precisa de genomas.8<\/sup> Los ARNg pueden disen\u0303arse para inducir DSB dirigidos en cualquier secuencia de ADN seleccionada tras la administracio\u0301n con Cas9, siempre que la secuencia objetivo este\u0301 cerca de un sitio PAM reconocido por la enzima Cas9 utilizada . La mayori\u0301a de las veces, este DSB se repara mediante mecanismos de unio\u0301n de extremos no homo\u0301logos (NHEJ), lo que conduce a inserciones y \/ o deleciones aleatorias (indeles) en el sitio de escisio\u0301n.4<\/sup> En experimentos recientes, se han logrado reducir genes que codifican para diferentes enfermedades como la funcio\u0301n del gen DMD <\/em>involucrado en la distrofia muscular de Duchenne.9 <\/sup><\/p>\n

    Distrofia Muscular de Duchenne<\/strong><\/p>\n

    La distrofia muscular de Duchenne es una miopati\u0301a hereditaria (conge\u0301nita) recesiva ligada al cromosoma X, una monosomi\u0301a debido a una mutacio\u0301n que afecta al gen de DMD <\/em>(Distrofia Muscular de Duchenne) lo cual causa una disminucio\u0301n de la protei\u0301na distrofina que a su vez causa una disrupcio\u0301n del complejo distrofina-glicoprotei\u0301na, que es importante para la integridad de la membrana del sarcolema.6<\/sup> Esta alteracio\u0301n genera un dan\u0303o progresivo en el mu\u0301sculo debido a la disminucio\u0301n de la protei\u0301na causando un deterioro muscular progresivo con complicaciones principalmente cardio-respiratorias y pe\u0301rdida ambulatoria.10<\/sup> Esta mutacio\u0301n puede ser causada por varios mecanismos principalmente por deleciones, pero adema\u0301s tambie\u0301n duplicaciones, inserciones o mutaciones puntuales en el gen de DMD <\/em>que se dan en las islas CpG de exones que generan un cambio en el marco de lectura por lo cual se produce usualmente un codo\u0301n de finalizacio\u0301n anticipado generando una protei\u0301na prematura con ausencia de produccio\u0301n de distrofina.2<\/sup><\/p>\n

    Actualmente se utilizan terapias farmacolo\u0301gicas para tratar los si\u0301ntomas de la enfermedad para mejorar la calidad y aumentar la sobrevida de los pacientes con corticosteroides (Pontevedra & Da Cun\u0303a, 2018) como una opcio\u0301n accesible pero no curativa, sin embargo se han propuesto terapias de edicio\u0301n gene\u0301ticas como CRISPR \/ Cas9 como herramienta alternativa para el tratamiento de mutaciones que generan patologi\u0301as como la DMD<\/em>.9<\/sup><\/p>\n

    Influencia del Sistema CRISPR\/Cas en el tratamiento de la DMD<\/strong><\/p>\n

    Dentro de los tratamientos que se pueden ofrecer para la Distrofia Muscular de Duchenne, los mecanismos de estos se pueden basar en 3 diferentes me\u0301todos (ver Figura 2.).4<\/sup> El primer me\u0301todo estudiado, un ADN gui\u0301a es usado para generar una escisio\u0301n dentro o cerca de un codo\u0301n de terminacio\u0301n, de algu\u0301n exo\u0301n mutado de la distrofia muscular de Duchenne, que ciertamente tiene la capacidad de restaurar de forma normal la configuracio\u0301n establecida o eliminar el codo\u0301n de terminacio\u0301n.4 5<\/sup> El segundo me\u0301todo, mejor conocido como classical exon skipping<\/em>, es ma\u0301s bien si el ADN gui\u0301a se enfoca en realizar escisiones en secuencias splicing de intrones y exones del DMD<\/em>, con el fin de brincarse el exo\u0301n alterado y continuar con la secuencia. Y por u\u0301ltimo, en el que dos ADNs gui\u0301a permiten la escisio\u0301n tanto en intrones como exones separados, se consigue que dos o ma\u0301s deleciones de exones puedan ser realizados y restaurar el marco de lectura del DMD<\/em>. 4<\/sup><\/p>\n

    Por otro lado se puede utilizar la herramientas CRISPR \/ Cas9 para corregir mutacio\u0301n de duplicacio\u0301n en el gen DMD <\/em>por medio de ARN que permite la delecio\u0301n de exones duplicados. Tambie\u0301n es importante mencionar que se pueden editar bases especi\u0301ficas de una secuencia utilizando este sistema, al utilizar una enzima Cas9 con nula actividad catali\u0301tica o nucleasas, que permiten hacer cortes en ADN. 4 7<\/sup><\/p>\n

    Otro acercamiento terape\u0301utico es la modulacio\u0301n transcripcional con el mismo sistema CRISPR \/ Cas9 al dirigirse a regiones promotoras del gen que produce utrofina, el cual es un homo\u0301logo de la distrofina que se ha demostrado que puede rescatar fenotipos de DMD esto se puede realizar mediante un aumento de la respuesta celular a trave\u0301s de esti\u0301mulos producido por el aumento de utrofina; utilizando enzimas Cas9 especi\u0301ficas se pueden realizar deleciones de regiones las cuales son el objetivo de ARNs inhibitorios por lo cual al eliminarse estas zonas producen aumento de utrofina porque los ARNs inhibitorios no actu\u0301an. 9 10<\/sup><\/p>\n

    Otros usos y descubrimientos destacados de CRISPR\/cas9 en el campo de la gene\u0301tica me\u0301dica en la actualidad<\/strong><\/p>\n

    A lo largo de esta revisio\u0301n se ha dado un enfoque especi\u0301fico a la herramienta de edicio\u0301n ge\u0301nica CRISPR\/cas como potencial terapia ge\u0301nica para la DMD y sus diferentes mecanismos de accio\u0301n. Sin embargo, como herramienta en la terapia ge\u0301nica se debe recordar que no es exclusiva para la DMD, sino que existen mu\u0301ltiples investigaciones actuales donde se estudian diferentes enfermedades que son potencialmente modificables a trave\u0301s de estas te\u0301cnicas. 1<\/sup><\/p>\n

    Enfermedades como el osteosarcoma (a trave\u0301s del silenciamiento del gen que codifica para la protei\u0301na Cdk11<\/em>) y la Fibrosis Qui\u0301stica (a trave\u0301s de la modificacio\u0301n del gen que codifica para el receptor CFTR <\/em>para recuperar el fenotipo normal), se han visto beneficiadas con el sistema CRISPR\/cas. 1 <\/sup>Adema\u0301s de las anteriores, al ser un tema tan actual tambie\u0301n es controversial y existen mu\u0301ltiples investigaciones que se esta\u0301n realizando en la actualidad que son destacadas.3<\/sup> Entre estas se pueden encontrar: Virus adeno-asociado (AAV) CRISPR\/Cas9 para reducir la expresio\u0301n de vegrfr2 <\/em>(receptor tipo 2 de factor de crecimiento endotelial vascular) y bloquear la angioge\u0301nesis in vitro, aplicacio\u0301n y optimizacio\u0301n de CRISPR \/ Cas9 mediante ingenieri\u0301a gene\u0301tica en ajolote (Ambystoma mexicanum<\/em>), CRISPR \/ Cas9 en la terapia del ca\u0301ncer, reduccio\u0301n de la latencia del herpesvirus asociado a Sarcoma de Kaposi, CRISPR \/ Cas9 como protector de la muerte neuronal en un modelo de la enfermedad de Parkinson. 1 3<\/sup><\/p>\n

    Por otra parte, el uso de CRISPR \/ Cas9 como terapia antiviral es un tema que esta\u0301 en constante actualizacio\u0301n. 3<\/sup> Por ejemplo, uno de los estudios ma\u0301s recientes demuestran su posible utilidad en el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), con el trasplante de ce\u0301lulas pluripotenciales inducidas de pacientes con mutaciones en el receptor CCR5. 3<\/sup> Otro de los virus estudiados para ser tratados con esta terapia ge\u0301nica han sido el virus de la hepatitis B (HBV), sin embargo al igual que el VIH, las investigaciones siguen en desarrollo.1<\/sup><\/p>\n

    Conclusiones<\/strong><\/p>\n

    La terapia ge\u0301nica y las posibilidades que hoy existen de utilizar el sistema CRISPR \/ Cas9 para la edicio\u0301n geno\u0301mica y sus mu\u0301ltiples aplicaciones, traen consigo un cambio en la evolucio\u0301n de la gene\u0301tica me\u0301dica. Enfermedades que por mucho tiempo se habi\u0301an considerado \u201csin cura o intratables\u201d ahora tienen la posibilidad de que se desarrolle una posible cura definitiva o por su parte una mejora considerable en la calidad de vida de las personas.<\/p>\n

    El ca\u0301ncer y las enfermedades monoge\u0301nicas, son de las patologi\u0301as ma\u0301s sometidas a investigacio\u0301n. Como se puede afirmar a partir de esta revisio\u0301n, la DMD a trave\u0301s de los diferentes me\u0301todos del sistema de edicio\u0301n geno\u0301mica CRISPR \/ Cas9 permiten editar el gen y asi\u0301 reducir la expresio\u0301n de \u00e9ste, lo cual parece prometer una posible solucio\u0301n a lo que se penso\u0301 por muchos an\u0303os ser una enfermedad incurable. A pesar de tener mucha evidencia cienti\u0301fica al di\u0301a de hoy, es un tema que esta\u0301 en constante actualizacio\u0301n. Por tanto, au\u0301n faltan mayores avances que traigan consigo ma\u0301s y mejores te\u0301cnicas que puedan alcanzar las metas con respecto a la mejora de la calidad de vida de cientos de miles de pacientes que di\u0301a con di\u0301a luchan contra este tipo de patologi\u0301as.<\/p>\n

    Ver anexo<\/strong><\/a><\/p>\n

    Referencias<\/strong><\/p>\n

      \n
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