Aislamiento, caracterización de cepas de actinomicetos
Los actinomicetos son microorganismos que se encuentran ampliamente distribuidos en diferentes tipos de suelos, aunque también se pueden encontrar en ambientes acuáticos y como comensales o parásitos de animales y plantas. 1
Aislamiento, caracterización de cepas de actinomicetos
Universidad de Granma
Centro de estudios de química aplicada
Autores:
Lic. María Antonia Salas González. Licenciada en Tecnología de la Salud en Servicios Farmacéuticos. Hospital Celia Sánchez Manduley
Dr.C. Profesor Titular Alejandro Alarcón Zayas. UDG Departamento de Química
MSc: Sandra Rodés Reyes. Profesora Asistente UDG .Departamento de Química
MSc: Yuleidis Arias Villavicencio. UDG Departamento de Biología
RESUMEN
Introducción:
Los principales géneros aislados a partir de suelos son Nocardia, Streptomyces y Micromonospora, que pueden estar presentes como conidias o como hifas vegetativas. Estos microorganismos están considerados como organismos promotores del crecimiento vegetal (OPCV), debido a que median una serie de mecanismos favorables para las plantas que pueden ser directos o indirectos tales como: fijación biológica de nitrógeno, solubilización de iones fosfato, producción de quelantes de hierro (sideróforos), fitohormonas y antibióticos, entre otros. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10
Objetivo: Aislar y caracterizar mediante técnicas microbiológicas de diferentes cepas de actinomicetos tolerantes a la salinidad.
Métodos: Las muestras de suelo se tomaron cerca de la zona radical de varias plantas de diferentes ecosistemas (marinos y terrestres) a una profundidad de 15 cm, las cuales se colectaron en frascos estériles. Las muestras de sedimentos marinos se tomaron a una profundidad de 1 m de la superficie del agua y excavando unos 5-10 cm en el sedimento. La mayor parte de las muestras provienen de suelos originalmente salinos (zona costera) y algunos de suelos salinizados fueron tomados del municipio Manzanillo, excepto M12 que proviene de un suelo no salino de la zona aledaña a la Universidad de Granma (Tabla 1). Se procedió al aislamiento de cepas de actinomicetos tolerantes a la salinidad. Luego se realizó la caracterización cultural de cepas de actinomicetos. Posteriormente al mantenimiento de las mismas.
Resultados: En resumen (Tabla 3), fue posible aislar 25 cepas de actinomicetos tolerantes a la salinidad a partir de suelo rizosférico de diferentes especies vegetales, localizado en la costa sur y en el centro de Granma. La mayoría de las colonias aisladas mostraron características culturales distintivas; sin embargo, de manera general son circulares, de bordes enteros o lobulados, elevadas hacia el centro y con presencia de estrías. Casi todas las cepas presentaron colonias de aspecto duro y color blanco en alguna parte de su estructura. Las cepas A3M4, A10M7 y A20M10 mostraron ser muy diferentes al resto dado que crecieron inmersas en el medio de cultivo y solo emergió una parte de la colonia con las estructuras reproductoras, lo cual puede ser indicativo de un bajo requerimiento de oxígeno (microorganismos microaerofílico).
Conclusiones: Se caracterizaron morfológicamente 25 cepas de actinomicetos aisladas a partir de muestras de suelo rizosférico de varias especies vegetales, predominando colonias circulares, de aspecto duro, bordes enteros o lobulados, elevadas hacia el centro, presencia de estrías y color blanco en alguna parte de su estructura. Las cepas A3M4, A10M7 y A20M10 son muy diferentes al resto dado que crecieron inmersas en el medio de cultivo y solo emergió una parte de la colonia con las estructuras reproductoras.
Palabras clave: Actinomicetos, microorganismos, rizosférico
Introducción
Los actinomicetos son microorganismos que se encuentran ampliamente distribuidos en diferentes tipos de suelos, aunque también se pueden encontrar en ambientes acuáticos y como comensales o parásitos de animales y plantas. 1 Los principales géneros aislados a partir de suelos son Nocardia, Streptomyces y Micromonospora, que pueden estar presentes como conidias o como hifas vegetativas. Estos microorganismos están considerados como organismos promotores del crecimiento vegetal (OPCV), debido a que median una serie de mecanismos favorables para las plantas que pueden ser directos o indirectos tales como: fijación biológica de nitrógeno, solubilización de iones fosfato, producción de quelantes de hierro (sideróforos), fitohormonas y antibióticos, entre otros. 2,3,4,5,6,7,8,9,10
Métodos
Las muestras de suelo se tomaron cerca de la zona radical de varias plantas de diferentes ecosistemas (marinos y terrestres) a una profundidad de 15 cm, las cuales se colectaron en frascos estériles. Las muestras de sedimentos marinos se tomaron a una profundidad de 1 m de la superficie del agua y excavando unos 5-10 cm en el sedimento. La mayor parte de las muestras provienen de suelos originalmente salinos (zona costera) y algunos de suelos salinizados fueron tomadas del municipio Manzanillo, excepto M12 que proviene de un suelo no salino de la zona aledaña a la Universidad de Granma (Tabla 1).
Aislamiento de cepas de actinomicetos tolerantes a la salinidad
Para el aislamiento de las cepas de actinomicetos a partir de suelos se siguió la metodología sugerida por Baskaran et al. (2011).11 Se pesaron 5 g de suelo rizosférico y se enrazó a 50 mL con agua destilada estéril. Se mezcló vigorosamente por 30 min. Se calentaron las muestras a 70 ºC por 15 min para disminuir el número de bacterias no esporuladas. Se realizaron diluciones seriadas decimales: 1 ml de muestra en 9 ml de agua destilada estéril, se agita por 3 min y se repite la acción para el resto de los tubos a partir del precedente. Se inocularon 100 µL de cada dilución en placas Petri conteniendo Agar Caseína-Almidón (ACA)(Anexo 2) con NaCl al 2% extendiendo el inóculo con espátula de Drigalsky y se incubaron durante 20 días a 28 ºC.
Culminado el tiempo de incubación, se aislaron mediante el método de estría o agotamiento las colonias filamentosas de aspecto seco y que mostraron características culturales diferentes. Las cepas se purificaron en ACA empleando el método de obtención de cultivo puro por estría o agotamiento y se mantuvieron frescas por el método de resiembra sólido-sólido. 12, 13
Caracterización cultural de cepas de actinomicetos
La caracterización macro-morfológica de cepas de actinomicetos se basó en la observación de las colonias al microscopio estereoscópico (Novel, China). La caracterización se realizó a colonias de actinomicetos seleccionados y crecidos en medio ACA a 28 ºC durante 7 días. Los aspectos a tener en cuenta incluyen: forma de las colonias (circular, filamentosa, puntiforme, etc.), forma de los bordes (enteros, irregulares, lobulados, etc.), elevación (cóncava, convexa y otras especificaciones), color, apariencia, entre otros.
Mantenimientos de las cepas
Las cepas de actinomicetos se conservaron mediante el método de resiembra sucesiva en medio ACA, Agar Extracto de Malta (AEM) y Agar Müeller-Hinton (AMH); y en crio-conservación a 35 ºC como suspensiones de esporas en glicerol al 60% (v/v).
Resultados
El método de aislamiento de actinomicetos empleado permitió obtener un total de 25 cepas (Tabla 2) a partir de suelos no anegados.
Se realizó la caracterización cultural de las colonias de actinomicetos de las diferentes muestras. En la Figura 2 se muestran colonias de dos actinomicetos (A1 y A2) aislados de suelo costero rizos férrico de Cocoloba uvifera en Manzanillo. En la Figura 3 se pueden observar colonias de tres cepas de actinomicetos aisladas de suelo rizosférico costero de flamboyán en Manzanillo (M4).
Las características culturales de las cepas de actinomicetos que se aislaron a partir de suelo costero rizosférico de Peltopborum ferruginium Benth (flamboyán) en Manzanillo se muestran en la Figura 4. Al realizar la caracterización de las colonias de los actinomicetos aislados a partir de suelo no costero rizosférico de Citrus limon, L. en Manzanillo (Figura 6). A partir de M12 correspondiente a suelo no costero rizosférico de guayaba tomado en Peralejo, Bayamo, se aislaron tres cepas