Inicio > Enfermedades infecciosas > Estudio histológico del granuloma hepático en Mus musculus con infección patente por Schistosoma mansoni

Estudio histológico del granuloma hepático en Mus musculus con infección patente por Schistosoma mansoni

Estudio histológico del granuloma hepático en Mus musculus con infección patente por Schistosoma mansoni

Autor principal: Davide Antonio Mobili Roccaro

Vol. XVIII; nº 2; 34

Histological study of hepatic granuloma in Mus musculus with patent infection by Schistosoma mansoni

Fecha de recepción: 26/12/2022

Fecha de aceptación: 27/01/2023

Incluido en Revista Electrónica de PortalesMedicos.com Volumen XVIII. Número 2 Segunda quincena de Enero de 2023 – Página inicial: Vol. XVIII; nº 2; 34

Autores:

Davide Antonio Mobili Roccaro, Leslie Andrea Marín Cardoza, Krisquely Veruska Cordero Sosa, Anthony Javier Ochoa García, Junedy Carolina Marcano Aguilera, Emilia Barrios, Valentina Patrizia Mobili Roccaro

Universidad Arturo Michelena, Valencia, Estado Carabobo, Venezuela. Universidad de Carabobo, Valencia, Estado Carabobo, Venezuela.

Resumen

Objetivo: Evaluar histológicamente el granuloma hepático en Mus musculus con infección patente por Schistosoma mansoni.

Método: El estudio se encuentra enmarcado bajo el diseño experimental. En cuanto a la población se emplearon cinco ratones Mus musculus, cuatro de los cuales fueron infectados con 150 cercarias de Schistosoma mansoni, a través de la vía percutánea, y uno empleado como espécimen fisiológico. A las 7 semanas de la infección se sacrificaron los cuatros ratones infectados y el fisiológico; mientras que la muestra está representada por cada hígado el cual se procesó histológicamente, seguidamente las secciones de 5µm fueron teñidas con Hematoxilina-Eosina para determinar el área de la respuesta inflamatoria y los tipos celulares presentes.

Resultados: Los resultados mostraron una respuesta granulomatosa de 11770±11654 µm2, con una gran variabilidad en el tamaño y celularidad del granuloma.  La respuesta granulomatosa alrededor de los huevos, estuvo constituida por macrófagos, plasmocitos, linfocitos, segmentados neutrófilos y eosinófilos, observándose diferencias en la distribución y tipo celular entre granulomas.

Conclusiones: Se observó una mayor extensión en la respuesta celular en función de la presencia de uno o más huevos del parásito. El hígado del ratón fisiológico se observó con aspecto y morfología de un órgano sano. Siendo las células más frecuentes en el infiltrado inflamatorio fueron los macrófagos, seguidos de los plasmocitos y los segmentados neutrófilos, en menor proporción los segmentados eosinófilos.

Palabras clave: histología, granuloma hepático, infección patente

Abstract

Objective: To evaluate histologically the hepatic granuloma in Mus musculus with patent infection by Schistosoma mansoni.

Method: The study is framed under the experimental design. Regarding the population, five Mus musculus mice were used, four of which were infected with 150 Schistosoma mansoni cercariae, through the percutaneous route, and one used as a physiological specimen. Seven weeks after the infection, the four infected mice and the physiological one were sacrificed; while the sample is represented by each liver which was processed histologically, then the 5µm sections were stained with Hematoxylin-Eosin to determine the area of ​​the inflammatory response and the cell types present.

Results: The results showed a granulomatous response of 11770 ± 11654 µm2, with great variability in the size and cellularity of the granuloma. The granulomatous response around the eggs consisted of macrophages, plasma cells, lymphocytes, segmented neutrophils and eosinophils, observing differences in distribution and cell type between granulomas.

Conclusions: A greater extension in the cellular response was observed depending on the presence of one or more parasite eggs. The liver of the physiological mouse was observed with the appearance and morphology of a healthy organ. The most frequent cells in the inflammatory infiltrate were macrophages, followed by plasma cells and segmented neutrophils, and to a lesser extent segmented eosinophils.

Keywords: histology, hepatic granuloma, patent infection

Los autores de este manuscrito declaran que:

Todos ellos han participado en su elaboración y no tienen conflictos de intereses
La investigación se ha realizado siguiendo las Pautas éticas internacionales para la investigación relacionada con la salud con seres humanos elaboradas por el Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ciencias Médicas (CIOMS) en colaboración con la Organización Mundial de la Salud (OMS).
El manuscrito es original y no contiene plagio.
El manuscrito no ha sido publicado en ningún medio y no está en proceso de revisión en otra revista.
Han obtenido los permisos necesarios para las imágenes y gráficos utilizados.
Han preservado las identidades de los pacientes.

INTRODUCCIÓN

El hígado es un órgano importante  que está presente tanto en el ser humano, como en todos los animales vertebrados. El hígado humano tiene un peso medio de 1500 gramos, ​está situado en la parte superior derecha del abdomen, debajo del diafragma, secreta la  bilis esencial para la digestión de las grasas y cuenta con otras muchas funciones, entre ellas la síntesis de proteínas plasmáticas, función desintoxicante   y  almacenamiento de vitaminas y glucógeno(1).

Es responsable de eliminar de la sangre diferentes sustancias que puedan resultar nocivas para el organismo entre ellas el alcohol, convirtiéndolas en inocuas. La ausencia de hígado o su falta de funcionamiento es incompatible con la vida. Se encuentra rodeado por el peritoneo visceral y presenta dos caras; cara anterosuperior convexa en contacto con el diafragma que lo separa de las bases pulmonares y la cara frénica del corazón, seguido de una cara posterior inferior, también llamada cara visceral pues en ella el hígado se relaciona con estructuras situadas en el lado derecho del abdomen, muchas de las cuales dejan una impresión en la cara inferior del lóbulo derecho del hígado. Así, se tiene de atrás hacia delante la impresión cólica determinada por el ángulo hepático del colon, la impresión duodenal marcada por el duodeno, pegada a la fosa cística donde se aloja la vesícula biliar (1).

Luego en la cara inferior del lóbulo izquierdo esta la impresión gástrica y la escotadura del esófago, en el borde posterior, en la base del hígado se encuentra la vesícula biliar y el hilio hepático, que es la zona de entrada de la vena porta, la  arteria hepática  y la salida del  conducto hepático. La estructura del hígado va a seguir las divisiones de la vena porta hepática. Tras la división de ramos segmentarios, las ramas de la vena porta, acompañadas de la arteria hepática y de las divisiones de los conductos hepáticos, se encuentran juntas en el espacio porta(1).

Clásicamente se considera al lobulillo hepático como la unidad funcional del órgano, un hígado humano contiene entre 50 000 y 100 000 lobulillos.​ Cada lobulillo, tienen forma hexagonal, en el centro del hexágono se encuentra la vena centro lobulillar y en las esquinas los espacios porta. Entre las esquinas del hexágono y el centro se encuentran los sinusoides hepáticos y los hepatocitos que se disponen en forma radiada en torno a cada vena centro lobulillar (2).

Así mismo en el lobulillo hepático se mezcla la sangre arterial y venosa, procedente de los espacios porta para desembocar en la vena central de cada lobulillo, dentro del lobulillo hepático se pueden distinguir las siguientes estructuras espacios porta o tríadas; son áreas triangulares situadas en los ángulos de los lobulillos hepáticos, constituidas por un estroma conjuntivo laxo; contienen en su interior una rama de la arteria hepática, una rama de la vena porta y un conductillo biliar (2).

Por lo tanto la bilis producida por los hepatocitos se vierte en una red de canalículos dentro de las láminas de hepatocitos y fluye, en forma centrípeta al lobulillo, hacia los conductillos biliares de los espacios porta sinusoides hepáticas son capilares que se disponen entre las láminas de hepatocitos y donde confluyen, desde la periferia de los lobulillos, las ramas de la arteria hepática y de la vena porta; la sangre fluye desde las tríadas hasta la vena central, circulando en forma centrípeta; la pared de los sinusoides está formada por una capa discontinua de células endoteliales fenestradas (2).

Por otra parte, en los sinusoides confluyen la circulación hepática y porta, estos drenan su contenido a la vena hepática central, de ésta a las venas hepáticas derecha e izquierda, y finalmente a la vena cava inferior. Espacio de Disse es un estrecho espacio perisinusoidal que se encuentra entre la pared de los sinusoides y las láminas de hepatocitos, ocupado por una red de fibras reticulares y plasma sanguíneo que baña libremente la superficie de los hepatocitos. En el espacio de Disse se produce el intercambio metabólico entre los hepatocitos y el plasma; forma la abundante linfa hepática (2).

También se encuentran células estrelladas hepáticas o células de Ito, de forma estrellada y su función es almacenar vitamina A. Las principales células que forman parte del lobulillo hepático son las siguientes; Hepatocitos, constituyen alrededor del 80 % de la población celular del tejido hepático. Son células poliédricas con 1 o 2 núcleos esféricos poliploides y un nucléolo prominente, presentan el citoplasma acidófilo con cuerpos basófilos, y son muy ricos en orgánulos. Además, en su citoplasma contienen inclusiones de glucógeno y grasa (3).

Al mismo tiempo la membrana plasmática de los hepatocitos presenta un dominio sinusoidal con microvellosidades que mira hacia el espacio de Disse y un dominio lateral que mira hacia el hepatocito vecino. Las membranas plasmáticas de dos hepatocitos contiguos  delimitan un canalículo donde será secretada la bilis. La presencia de múltiples orgánulos en el hepatocito se relaciona con sus funciones; síntesis de proteínas, metabolismo de hidratos de carbono, formación de bilis, catabolismo de fármacos, tóxicos, el metabolismo de lípidos y gluconeogénesis (3).

Por último las células de Kupffer; son macrófagos fijos pertenecientes al sistema fagocítico mononuclear que se encuentran adheridos al endotelio y que emiten sus prolongaciones hacia el espacio de Disse, estas células eliminan de la circulación sanguínea, mediante el proceso de fagocitosis, todo tipo de partículas extrañas, innecesarias o alteradas, incluyendo eritrocitos envejecidos y bacterias; además actúan como células presentadoras de antígeno y activan la respuesta inmune de los linfocitos T. siendo estos una célula multifuncional (3).

De igual manera se encuentran Células endoteliales, estas células tapizan la luz de los sinusoides, tienen un citoplasma fenestrado (con poros) a través del cual penetran los componentes de la sangre en dirección hacia la membrana sinusoidal de los hepatocitos, y a su vez células ductales: que  forma la pared de los pequeños ductos por los que circula la bilis (3).

Por otra parte, diversas enfermedades infecto-contagiosas pueden inducir daño hepático, de estas resaltan las hepatitis ocasionadas por virus e infecciones ocasionadas por parásitos. En este último grupo, se puede ubicar la infección por el parásito Schistosoma mansoni, agente causal de la esquistosomiasis en América del Sur. La esquistosomiasis ocasionada por esta especie de parásito afecta un promedio de 200 a 300 millones de personas a nivel mundial. En consecuencia entre los continentes  afectados esta América Latina y países destacados como República Dominicana, Puerto Rico, Suriman, Brasil y Venezuela. Dado que la esquitosomiasis es una parasitosis producidas por helmintos trematodos del género Schistosoma. Existen 7 especies que afectan al ser humano como lo es  Schistosoma  mansoni (4).

En Suramérica la única especie existente es el Schistosoma  mansoni los esquitosomas adultos miden entre 7 y 20mm de longitud, tienen un cuerpo cilíndrico con 2 orificios succionadores muy característicos, los esquistosomas no son hermafroditas, se diferencian sexualmente a gusanos machos y hembras, la hembra produce entre 300 huevos por día, teniendo este un hospedador intermedio un molusco planorbideo denominado Biomphalaria glabrata, el cual habita en aguas dulces (riachuelos, ríos, lagunas)  hasta llegar a su hospedador final, mamíferos roedores en el medio silvestre o el humano (5).

Por su parte el ciclo de vida de este parásito se inicia cuando los huevos salen del huésped con las heces y la orina eliminados cerca de corrientes de agua, donde habita el caracol, eclosiona y libera una larva ciliada denominada miracidio, en el medio ambiente al entrar en contacto con aguas dulces y en dependencia de la temperatura alrededor  de  28°C. La sobrevida del miracidio en el agua es limitada, ya que conservan su capacidad de penetración hasta unas cuatros horas después de la liberación del huevo, luego de las ocho a las doce horas muere si no encuentra a su hospedador intermedio Biomphalaria glabrata, una vez que las cercarías (forma infectiva para el hombre) salen del caracol en busca del hospedador definitivo, penetra a través de la piel de este (5).

Finalmente transformado en una larva denominada cercaría, está en el medio exterior acuático se ubica y penetra al hospedador definitivo  a través de la piel sana con la ayuda de secreciones  enzimáticas tipo elastasas, capaces de fragmentar la queratina y colágeno de la piel, el parásito en la piel se denomina esquistosómulo que a través de los vasos cutáneos. Estos son arrastrado pasivamente por la circulación hacia la red vascular, luego una semana después, los esquistosómulos  se ubican en el sistema porta-hepático (6).

Una vez allí crecen y entre las semanas dos y tres maduran y se diferencian sexualmente a gusanos machos y hembras que migran en pareja contra corriente hacia las venas mesentéricas inferiores y plexo hemorroidal superior, según ciertas características morfológicas y clínicas, la enfermedad puede clasificarse esquistosomiasis aguda o crónica (6).

Aunque esto conlleve a una patología evidente, cuando mueren estos huevos pueden ser arrastrados por la circulación hacia los vasos intrahepáticos obstruyendo la circulación y sensibilizando el tejido. Lo cual desencadena un proceso inflamatorio de los mismos con la consecuente formación del granuloma, la inflamación hepática ocasionada por la respuesta inmune del hospedador, frente a los antígenos del huevo del parásito, se mide de acuerdo al tamaño del granuloma (5).

En relación a esto se conoce que la respuesta inmunitaria inducida por los huevos de Schistosoma mansoni es un mecanismo de protección iniciada por el hospedador que paradójicamente es el responsable de la patología cuando la infección se hace crónica, la presencia de estos huevos en el tejido hepático provoca la estimulación de células del sistema inmune como lo son macrófagos, neutrófilos, eosinofilos hasta la intervención de linfocitos T y B (5).

Por otra parte, se ha demostrado que la longitud y el tamaño de los granulomas son proporcionales a la persistencia del huevo en la lesión y la capacidad de las células inmunes o inflamatorias del hospedador para destruir antígenos, a su vez indican que a mayor tamaño de los huevos estos aportan más epitopes antigénicos a ser procesados por mecanismos de defensa del hospedador. En cuanto a la composición celular observaron que los granulomas presentan mayor cantidad de macrófagos, plasmocitos y pequeños focos de neutrófilos (7).

A su vez, en las primeras semanas de la infección se estimulan la producción de mediadores relacionados con estas células. De manera que la respuesta granulomatosa, es rica en eosinófilos, macrófagos y células Th2 que actúan para proteger el tejido del hospedador de las toxinas  liberadas por el huevo, proporcionando una barrera física y secuestrando los productos antigénicos secretados por el parásito (8).

Seguido en un estudio indican que a medida que el huevo degenera, ocurre una regeneración parcial del tejido donde los fibroblastos ocupan la zona en el cual se encontraba el huevo y los granulomas en la esquitosomiasis. En este orden de ideas refieren que los granulomas en la esquistosomiasis desarrollan en dos etapas la pre-granulomatosa y la granulomatosa. Por ello la primera corresponde a la etapa más temprana de la respuesta granulosa y se caracteriza por una incorporación desordenada de células y la segunda se asocia con una estructura más delineada y corresponde a etapas más tardías de esta fase, el miracidio que habitaba dentro del huevo ha muerto por lo que la estructura se desintegra, lo que se asocia con una reducción en la respuesta inflamatoria y por ende en una reducción significativa del tamaño (9).

No obstante, los daños producidos por el parásito pueden deberse sucesivamente a las cercarías a su paso por la piel, a los gusanos adultos dentro de los vasos del sistema porta, bien en el intestino o dentro del hígado. A su paso por la piel, las cercarías, además del efecto traumático pueden originar procesos inflamatorios (dermatitis) a causa de la hipersensibilidad que inducen, así como la crisis de urticaria por las mismas razones. Los parásitos adultos cuando mueren son arrastrados hasta los vasos intrahepaticos. A su vez pueden, por acción mecánica, obstruir esos vasos o producir reacciones inflamatorias en sus paredes, además, sus productos de excreción (cuando vivos) o de destrucción (cuando mueren) sensibilizan y causan lesiones inflamatorias difusas en órganos como intestino, hígado, bazo, pulmón entre otros, que aparentemente no tiene traducción clínica importante, pero el agente más importante es el huevo (10).

Así mismo este induce a su alrededor una reacción inflamatoria llamada granuloma, inmunológicamente específica, del tipo denominado  inmunidad mediada por células  o tipo IV dependiente de  linfocitos T, el granuloma es modulado inmunológicamente a lo largo de la infección, siendo grande al principio, posteriormente reduce su tamaño y es sustituido por tejido fibroso cicatricial, se trata en principio de una respuesta inmunológica beneficiosa, ya que protege contra los antígenos solubles  del huevo los cuales son muy tóxicos (10).

A de medida que aumenta la fibrosis, se llega a reducir e inclusive impedir el flujo sanguíneo en el sitio de obstrucción (espacioeriportal), conducción a la hipertensión portal con su patología clásica de hepato-esplenomegalia, ascitis, y red venosa colateral; en todos estos procesos patogénicos tienen gran importancia la intensidad de la infección o carga parasitaria, las reinfestaciones y el estado inmunológico (10).

Posteriormente en los hombres como en los diferentes animales susceptibles a la infección, pueden desarrollar una resistencia parcial a la infección por Schistosoma  mansoni. Gracias a esa resistencia, gran número de cercarías y esquistosomulos pueden ser destruidos  a su paso por los tejidos, es una forma de inmunidad concomitante que estimulan los parásitos adultos, pero el efecto se ejerce sobre las formas en desarrollo (11).

Por esta razón en la esquistosomiasis se pueden distinguir varias formas patológicas. Forma aguda o toxemica. Forma con acentuado grado de hipersensibilidad, alrededor de los huevos aparece un área de necrosis, agregados de macrófagos y eosinofilos. Etiológicamente pudiera ser una forma tipo enfermedad del suero (11).

Siendo la forma crónica leve; la más frecuente, se presenta en individuos aparentemente asintomáticos o con sintomatología intestinal solamente; alrededor del huevo se desarrolla un infiltrado linfohistiocitario con tendencia fibrotica o cicatricial. Las lesiones ocurren fundamentalmente en el hígado forma crónica grave. Ocurre en la forma hepato-esplenico, porque además de las lesiones fibroticas hepáticas, se agrega la esplenomegalia. La fibrosis hepática a nivel de los espacios portales se hace intensa y puede originar la hipertensión portal, con la aparición de las varices esofágicas. Su sintomatología se pueden distinguir los siguientes periodos clínicos, en relación con las formas antomopatologicas no es obligatorio que todos los pacientes pasen sucesivamente por todos ellos (11).

Tipo II hepato-instestinal; síntomas intestinales semejantes a diarrea con o sin disentería mayor porcentaje de casos con diarrea y epigastralgia hígado aumentado de volumen, bazo no palpable, examen de heces positivo; eosinofilia, reacción intradérmica positiva. Tipo III hepato-esplenico; fase compensada además de la sintomatología intestinal, presentan hígado aumentado de volumen, con tendencia a los grandes hígados y bazo palpable estado general deficiente, el examen de heces puede ser negativo y entonces se debe   practica una biopsia rectal intradérmica positiva (11).

Puesto que también presenta eosinofilia, y anemia moderada; Finalizando con una Tipo IV hepato-esplénico; fase descompensada grandes esplenomegalia, bazos palpables hasta  o más allá de la cicatriz umbilical, hígado pequeño contraído, o también hepatomegalia, frecuentemente ascitis, hematemesis y circulación colateral, perturbaciones frecuentes en el aparato respiratorio, enflaquecimiento, desnutrición, examen de heces puede ser negativo , se debe entonces practicar la biopsia rectal, tendencia a la leucopenia, anemia acentuada, eosinofiliamenos  acentuada (11).

Según la investigación realizada por Amaral K, Silva T, Dias F, Malta K, Rosa F, Costa-Neto S, Gentile R, Melo R. En el año 2017 en Brasil se dio a conocer dicha investigación titulada; Evaluación histológica de granulomas en Infecciones de Schistosoma mansoni naturales y experimentales utilizando imágenes de diapositivas completas. Teniendo como objetivo general evaluar los granulomas por métodos de microscopia es lento y limitado, en estudios a gran escala, la patología de la esquistosomiasis, enfermedad tropical ocasionada por el parásito Schistosoma mansoni, es consecuencia de los huevos atrapados en  hígado e intestino del hospedador, los huevos conducen al reclutamiento de células inflamatorias (12).

Seguidamente formando granulomas periovulares, el propósito del estudio fue evaluar la respuesta granulomatosa en hígado e intestino de modelos experimentales en (Nectomyssquamipes un reservorio salvaje) y experimental (ratón suizo), mediante el uso de imágenes de diapositivas completas de alta resolución (IDAR). IDAR y el análisis cuantitativo, permitieron una evaluación rápida y confiable del número, tipos evolutivos, frecuencia, áreas de granulomas e infiltrados inflamatorios que revelaron que los órganos diana se impactan de forma diferencial. Dado por la respuesta inflamatoria. Se observó gran diferencia en el número de eosinófilos entre las infecciones en modelos salvajes y experimentales. Por tanto, IDAR puede ser una herramienta para el análisis histológico detallado y preciso de granulomas y otros aspectos patológicos en estudios clínicos y de investigación de la esquistosomiasis (12).

Por esta razón en la esquistosomiasis crónica los huevos de Schistosoma mansoni se encuentran atrapados en los tejidos, provocando obstrucción hepática, tal obstrucción promueve reacciones inflamatorias y granulomatosas, las cuales son ocupadas por depósitos fibróticos, cuya severidad depende tanto de la magnitud de la infección, como de la respuesta inmune del hospedador (13).

La patología ocasionada por Schistosoma mansoni se relaciona con la estimulación de las proteínas de los huevos del parásito al sistema inmunitario del hospedador (humanos y mamíferos roedores), ocasionando la migración de células del sistema inmune del hospedador hacia los tejidos afectados donde quedan atrapados los huevos, principalmente en hígado por tanto las células del sistema inmunitario del hospedador se alojan alrededor de los huevos en el tejido, formando un granuloma (14).

Esta lesión que puede ubicarse además de hígado, en intestino; en pulmones, bazo, riñón, estomago, musculo esquelético y ganglios linfáticos similarmente, la patología  en animales infectados con Schistosoma mansoni se atribuye principalmente a la respuesta  inflamatoria  contra los huevos del parásito, la cual alcanza su máxima expresión a las 8 semanas de la infección en hospedadores susceptibles, entre ellos el ratón; la respuesta granulomatosa es inicialmente una reacción de hipersensibilidad retardada mediada por linfocitos T e inducida por los antígenos solubles del huevo de Schistosoma  mansoni (14).

En otro aspecto sabiendo que la esquistosomiasis es una enfermedad parasitaria, siendo esta endémica de la región Centro-Norte de Venezuela, debido a que en esta región del país se encuentran las condiciones geográficas y ecológicas que permiten la multiplicación del caracol hospedador intermediario, Biomphalaria glabrata; contribuyendo en la transmisión de la infección en el humano, las actividades económicas que desarrollan las personas en esa región del país, como son, labores agrícolas.

Estas se desarrollan en sitios con grandes extensiones de lagunas, arroyos de curso lento, ideales para la reproducción del caracol. En nuestro país hacer el diagnóstico de la infección es un problema adicional, debido a que las personas se infectan con bajas cargas parasitarias y la emisión de huevos de Schistosoma mansoni es escasa, lo que complica el diagnóstico del paciente a través de la búsqueda de los huevos en las heces.

Ciertamente los problemas con el diagnóstico de las personas infectadas y la posibilidad de una sola opción de tratamiento de las personas con esquistosomiasis, es altamente preocupante, puesto que existen fuertes evidencias de que la infección  por Schistosoma mansoni puede estar relacionada con el desarrollo de cáncer hepático o intestinal, la problemática previamente planteada, pone en evidencia, la importancia de estudiar la extensión del daño hepático y que elementos celulares de la respuesta inmune  del hospedador forman parte de la respuesta granulomatosa hepática.

Como una primera aproximación a la comprensión de la patología hepática ocasionada por Schistosoma mansoni, se ha empleado un modelo murino, dado que estos son un tipo de ratón genéticamente idéntico, con sepas isogenico  siendo  buenos hospedadores definitivos, teniendo esta condición, es utilizado en los estudios histológicos e inmunológicos, ya que su respuesta es muy parecida a la del humano; pudiendo incluso sentar las bases para iniciar nuevas estrategias de tratamiento para la esquistosomiasis; basándose dicha  investigación en un objetivo general que es evaluar histológicamente el granuloma hepático en Mus musculus  con infección patente por Schistosoma mansoni.

MÉTODO

La presente investigación se encuentra enmarcada bajo un enfoque cuantitativo el cuál es secuencial y probatorio con base en la medición numérica y el análisis estadístico, una vez precisado el alcance de la investigación se determina el diseño, siendo éste experimental ya que se utilizan cuando el investigador pretende establecer efecto de una causa que manipula, por lo tanto consiste en someter a un objeto o grupo de individuos a determinadas condiciones para observar efectos que se producen. Este diseño de investigación se enfoca en la manipulación de variables, teniendo como nivel presencia-ausencia ya que existen dos grupos, uno de control al cual no se le realiza ningún experimento, es decir, está ausente la variable independiente y por último se encuentra el grupo experimental, que es aquel que recibe el tratamiento o estímulo experimental, es decir, se expone a la variable independiente (15).

En cuanto a las variables de estudios, se determinan las variables dependientes e independientes. La dependiente es el efecto de la infección a Mus musculus, mientras que las independientes son: la cantidad de cercarías de Schistosoma mansoni y tiempo de inoculación del Mus musculus en el baño de las cercarías de Schistosoma mansoni, ya que ellas son las encargadas de variar el estado de salud del Mus musculus y el aspecto tanto macroscópico y microscópico del hígado del Mus musculus.

Ahora bien, ya definido el diseño y las variables de estudio, se debe determinar la población que puede ser definida como el conjunto finito o infinito de elementos, personas o cosas pertinentes a una investigación y que generalmente suelen ser inaccesibles, por lo tanto la población es de cinco ratones Mus musculus, a partir de esto, cuando el investigador selecciona una muestra, está obligado a decidir los mecanismos que aplicara para obtenerla, este proceso se le denomina muestreo y este es de tipo no probabilístico, el cual se usa cuando no se puede determinar la probabilidad de  tipo intencional.

Basándose en esto, el investigador establece previamente los criterios para seleccionar las unidades de análisis, las cuales reciben el nombre de pruebas de tejido de hígados de cada uno de los Mus musculus. Para tabular los datos se encuentran los instrumentos de recolección de datos, siendo estos la ficha de registro y lista de cotejo, donde se pueden evidenciar los cambios macroscópicos y microscópicos del hígado de Mus musculus (16).

En la recolección de datos de la ficha de registro, se observó que el espécimen fisiológico tenía un estado de salud óptimo y un peso de 20gr; a los especímenes experimentales se le observaron una serie de cambios, ya que estos fueron expuesto a un proceso de inoculación donde dependiendo de su peso se expusieron a un número de cercarías.

Basado en una medida donde no fuera muy baja la carga parasitaria, ni muy alta, produciendo una infección patente de 7 semanas, donde el primer espécimen pesó 20gr luego de la inoculación con 150 cercarias, después de la infección de 7 semanas presento un estado de salud sospechoso y un peso de 18gr con los previos efectos de la infección como diarrea y debilidad; el segundo espécimen antes de ser expuesto a la inoculación con 150 cercarias.

Tenía un estado de salud optimo y un peso de 18gr a las 7 semanas de infección su estado de salud cambia a sospechoso, siendo su peso es de 17gr presentando los mismo síntomas, diarrea y debilidad, de igual manera el  tercer espécimen antes de ser expuesto a la inoculación con 150 cercarias,  su estado de salud era optimo y su peso era de 20gr,  y luego de la infección de 7 semanas  pasa a ser un estado de salud sospechoso, y su peso cambia a 18gr, presentando los síntomas ya mencionados diarrea y debilidad.

Por último, el cuarto espécimen antes de la inoculación con 150 cercarias, su estado de salud era optimo y su peso era de 18gr, después a las 7 semanas de infección, presenta los mismos síntomas que los anteriores su peso cambia y es de 17gr y su estado de salud pasa a ser sospechoso. Luego del tiempo respectivo de infección éstos fueron sacrificados, siguiendo los lineamientos del Código de Bioética y Bioseguridad del FONACIT (2014).

La histopatología hepática; permitirá evaluar la respuesta inflamatoria granulomatosa en los animales infectados, también el estudio de los diferentes tipos celulares en cada órgano para ello, luego de ser sacrificados en el laboratorio de Helmintología del Instituto de Biología Molecular de Parásitos Instituto Biomol, haciéndole su respectiva autopsia, bajo la supervisión de Emilia Barrios Licda. En Bionálisis, Dra. en ciencias biológicas mención zoología, profesora de la escuela de Bionálisis y directora del mencionado instituto con participación de la TSU Citotecnólogo. Jennifer Ayala.

Seguidamente se extrajo el hígado del espécimen fisiológico presentando los aspectos macroscópicos normales, de un hígado sano los cuales fueron que su color era rojo, su superficie lisa y su consistencia blanda, los hígados extraídos de los experimentales infectados presentaron una serie de cambios muy notables, el experimental uno su hígado tenía un aspecto macroscópico, de un hígado anormal.

Teniendo color marrón oscuro, una consistencia firme y una superficie rugosa, el segundo espécimen infectado tiene las mismas características macroscópicas un color marrón oscuro, una consistencia firme y una superficie rugosa, seguidamente el tercer espécimen infectado sigue con los lineamientos macroscópicos de los anteriores y presenta un color marrón oscuro, una consistencia firme, y una superficie rugosa.

Por último el hígado del cuarto espécimen infectado presento de igual manera las características macroscópicas de un hígado anormal, color marrón oscuro, consistencia firme y superficie rugosa, luego estos fueron fijados por perfusión Portal en mezcla de paraformaldehido (4%)-glutaraldehído (0,2%) en tampón fosfato Millonig (0,1 M; pH 7,2 – 7,4) procesados en el laboratorio de procesamiento de la Universidad Arturo Michelena, por un procesador automático marca AutotechniconDuo que cuenta con once reactivos estos serán procesados durante 12 horas.

Empezando por la deshidratación del tejido siendo el proceso que tiene por finalidad la remoción o eliminación completa del agua de los tejidos, mediante siete alcoholes de forma creciente al 70% 80% 90% 100% 100% 100% 100%, durante un tiempo en función del volumen de los fragmentos tisulares y de su contenido de agua, debe ser completa y evitar exposiciones prolongadas para no provocar el endurecimiento de los tejidos,  luego pasa por el proceso de aclaramiento; las muestras deshidratadas se encuentran totalmente embebidas en  propanol, pero la parafina tampoco es soluble en alcohol por lo que es necesario remplazarlo por sustancias que sean capases simultáneamente de mezclarse con el alcohol y disolver la parafina,  a estos líquidos diafanizadores o intermediarios el líquido diafanizador  de uso más frecuente es el xilol siendo este un agente aclarante por excelencia en el laboratorio de patología es usado como aclarante.

Durante el procesamiento de tejido gracias a que actúa rápidamente y produce pocos efectos sobre la consistencia y la morfología tisular del tejido, contando el procesador con dos xilol realizando dos baños sucesivos  de una hora cada uno, terminando con el proceso de infiltración que es el proceso que tiene por objeto rellenar completamente la muestra histológica con el medio que se va a utilizar para la imbibición del tejido, la técnica se fundamenta en remplazar el agua tisular por un medio que penetre los espacios intersticiales e intracelulares y le dé al tejido homogeneidad y la dureza.

Para  luego obtener cortes finos y de calidad usando este procesador dos  baños de parafinas a una temperatura de 60ºC, continuando a ser incluidos en parafina en un casete de inclusión de poliestireno, la inclusión es el proceso en el cual el tejido es rodeado de una sustancia liquida la cual mediante al alcanzar su punto de fusión tomara una consistencia firme, con la finalidad de conferirle soporte al tejido que se va seccionar al micrótomo, donde se utilizara un dispensador de parafina y una plancha de calentamiento a una temperatura de 50ºC.

Siendo está de marca Fargo HP-205N.  Después de la confección del bloque, se pasa a realizar secciones histológicas con su previo desbastado que es la eliminación de las capas de parafina entre 10 µm hasta se observen que salen las sesiones de tejido, se cambia el micrage y se comienza a cortar en 5µm, estas se teñirán con hematoxilina-eosina. Las secciones hepáticas obtenidas de un micrótomo de rotación, marca RechertJum con una cuchilla de alto perfil marca Leica 819ºtermo shaldo.

Donde se extenderán los cortes para luego proceder a la captura de los cortes, en láminas porta-objeto en rotuladas, marca Slides Ground Edges, previamente tratadas con poli-L-lisina (20 mg% en agua destilada). Posteriormente, éstas serán incubadas a 60 ºC. Antes de iniciar el proceso de coloración hay que secarlas para evitar el desprendimiento; en una estufa marca Quincy Laboratorio Inc. Modelo 10 Lab Oven a 30min, a una temperatura de 60ºC. El desparafinado se realizará con 2 xilol 5 min cada uno; luego de esto, se hidratará el tejido.

Mediante una cadena creciente de propanol (100%, 90%, 80 % v/v) por 3 min cada uno, seguido de un lavado con agua destilada. A continuación, se procederá a colorear con una solución de hematoxilina de Mayer por 6 min; es un componente natural obtenido de una planta leguminosa (Haematoxylumcampechianu); la hematoxilina tiene que ser oxidada a hemateína antes de ser usada como colorante y combinada con un metal que actuará como mordiente.

Dado a que la oxidación puede ser química o por el oxígeno mediante el envejecimiento de la solución. Es el producto oxidado de la hematoxilina, es la hemateína, la que realmente se adhiere a las sustancias ácidas del tejido, fundamentalmente tiñe el núcleo. Transcurrido el tiempo, se lavará con agua destilada. La tinción del citoplasma se realizará con una solución de eosina al 1% diluida en etanol por 30seg, es un colorante llamado así por su color rosa es un polvo rojo, soluble en alcohol, o soluciones alcalinas.

Tiene carácter ácido, por lo cual tiñe sustancias básicas, que a su vez son denominadas eosinófilas por su afinidad por la eosinalo que le permite enlazarse con constituyentes celulares de carga positiva. Por ello colorea componentes y orgánulos citoplasmáticos, colágeno y fibras musculares, pero no los núcleos, por lo tanto  los tejidos se deshidrataran.

Mediante una cadena decreciente de propanol (80%, 90%, 100% v/v) por 3 min cada uno; seguido de 2 xilol 5 min cada uno, llevándose luego a un medio de montaje Marca (Montex) y unas laminillas cubre objeto de 24mmX40mm marca Gaesca, en la evaluación de la respuesta inflamatoria hepática; Las observaciones y el registro fotográfico.

Se realizarán en un microscopio Nikon E-600 con cámara digital Coolpix 995. Observados en los objetivos de 10x, 20x, 40x y 100x Se describió el tejido a partir del registro digital, primero, en función de su celularidad y segundo, a través del tamaño de la respuesta inflamatoria, tomando en cuenta el desarrollo de fibrosis y el área del granuloma.

Calculada a partir de una escala de lámina calibrada al mismo aumento de la fotografía analizada. Todos estos análisis digitales son realizados con software analizador de imágenes (ImageJ 1.50b); En los análisis de los resultados; Se identificarán los tipos celulares en las secciones teñidas con H&E y se expresarán como el promedio±desviación estándar, estableciendo si existen diferencias estadísticamente entre el animal fisiológico y los experimentales.

DISCUSIÓN

El análisis histopatológico, obtenido del ejemplar fisiológico usado como método de comparación, reveló en las secciones de hígado, la histología normal dado que se observaron las venas centro lobulillar rodeadas de cordones de células hepáticas o hepatocitos, con aspecto y morfología característica, para individuos sanos.

Luego el área de la respuesta inflamatoria hepática en ratones Mus musculus con 7 semanas de infección fue 11770±11654 µm2 (promedio ± desviación estándar), lo que evidencia una gran variabilidad en el tamaño de los granulomas en ese período de infección, con un área mínima de 1548 µm2 y una máxima de 94848 µm2. Similarmente, se aprecia una respuesta concéntrica más grande cuando ésta se forma alrededor de dos o más huevos.

La conformación del infiltrado inflamatorio hepático desarrollado en respuesta a uno o más huevos de Schistosoma mansoni, denominado granuloma se observó en forma concéntrica alrededor de estos y constituida por distintos tipos celulares, entre los que podemos mencionar; macrófagos, plasmocitos, linfocitos y segmentados neutrófilos.

Seguidamente se observó diferencias en la extensión y tipo celular del infiltrado inflamatorio, alrededor del huevo y del gusano adulto de Schistosoma mansoni. La respuesta inflamatoria desarrollada frente al gusano adulto estuvo constituida principalmente de linfocitos y fue menos extensa que la desarrollada frente a huevo por otra parte los granulomas formados alrededor de huevos intactos en los que se aprecia la cubierta calcárea rodeando al miracidio presentan un infiltrado inflamatorio de área máxima.

Mientras que los que se presentan en el centro miracidios desprovistos de la cubierta calcárea, suelen ser de área intermedia y aquellos en los cuales el miracidio pierde su morfología característica y se observan deformados, se aprecia que corresponden con los granulomas de área mínima. Por otra parteen los tipos celulares que constituyen el infiltrado inflamatorio fue variable en los granulomas, dependiendo del tamaño.

En granulomas de área máxima se observó un cúmulo de macrófagos con pigmento esquistosomal y segmentados neutrófilos escasos, en la zona interna del granuloma, correspondiente a las células que se encuentran más cercanas a los huevos; también en otras secciones hepáticas de ratones Mus musculus con 7 semanas de infección, los granulomas de área máxima.

Presentaron predominio de macrófagos en la zona interna del granuloma y plasmocitos en la zona externa del granuloma; los granulomas de área mínima, presentaron un infiltrado de macrófagos dispuestos en una hilera alrededor del huevo, que se continúa con plasmocitos y neutrófilos en la capa media; En escasas secciones hepáticas se encontró un predominio de macrófagos y plasmocitos y en la capa interna del granuloma y escasos segmentados eosinófilos en la capa más externa del granuloma.

Por otra parte, la gran variabilidad en el área de la respuesta inflamatoria hepática desarrollada en los ratones Mus musculus con 7 a semanas de infección parece obedecer a la presencia de huevos con distintos tiempos de permanencia en el tejido, de manera que la respuesta desarrollada alrededor de los huevos con más tiempo en el tejido, va disminuyendo en tamaño, en contraste, los huevos recientemente depositados en el tejido.

Estos desarrollan una respuesta inflamatoria máxima, posiblemente relacionada con una mayor estimulación del Sistema Inmune del ratón, por los antígenos de los huevos cuyo miracidio interno continúa produciendo proteínas y enzimas, estos hallazgos confirman lo que reporta la literatura en relación a que los granulomas constituyen estructuras que se desarrollan como parte de la respuesta inmune protectora del hospedador para encapsular objetos extraños al organismo.

De tal modo que la respuesta granulomatosa inflamatoria estuvo constituida por distintos tipos celulares como: macrófagos, plasmocitos, linfocitos, segmentados neutrófilos y segmentados eosinófilos, coincidiendo con literatura previa así mismo se observó diferencias en el área del granuloma en función del tiempo de permanencia del huevo en la lesión, en huevos recientemente colocados en el tejido.

Por una parte el área que ocupa el infiltrado inflamatorio es máxima, disminuyendo hasta hacerse mínima alrededor de los huevos que han perdido la cubierta calcárea que los recubre y el miracidio muere, aspectos que corroboran estudios previos del grupo de investigación, por otra parte los tipos celulares que constituyen el infiltrado inflamatorio fueron variables, en los granulomas de área máxima la célula que predomina son los macrófagos, seguidos de los plasmocitos, los segmentados neutrófilos y en menos proporción por los segmentados eosinófilos.

En relación a lo cual algunos autores refieren que el predominio de este tipo celular depende del tiempo de infección del animal; Otra posibilidad es la influencia de factores genéticos de la raza o constitución genética del ratón, que determinan la presencia predominante de un tipo celular u otro.

Con respecto a lo anteriormente abordado se puede decir que se relaciona el Estudio Histológico del granuloma hepático en Mus musculus con infección patente por Schistosoma mansoni; con el trabajo desarrollado en Brasil el año 2017 titulado Evaluación histológica de granulomas en Infecciones de Schistosoma mansoni naturales y experimentales utilizando imágenes de diapositivas completas. Dando unos resultados en relación a ambos proyectos de investigación demostrando la importante función que cumplen los macrófagos en la conformación del granuloma, de los ratones infectados, así como la presencia de otros tipos celulares (plasmocitos, segmentados neutrófilos y eosinófilos) principalmente porque estos pueden sufrir diferentes tipos diferentes tipos de células, lo que puede influir en su estructura.

La contribución principal del presente estudio  fue aportar información en  la comprensión de la composición celular y extensión del infiltrado celular en el tejido hepático de Mus musculus infectado con Schistosoma mansoni  en comparación con animales no infectados; se recomienda a trabajo posteriores de investigación, realizarlos comparativos con el estudio de granuloma hepático producido por Schistosoma mansoni en diferente semanas o etapas de la infección basándose en el estudio de diferenciación  del tamaño del granuloma; otro estudio podría ser el daño producido por la cercaría de Schistosoma mansoni en su paso por la piel estudiando a  fondo el efecto traumático que pueden originar procesos inflamatorios.

Ver anexo

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

  1. Geneser F. Histología. 3a Ed. Buenos Aires: Médica Panamericana; 2000.
  2. Ross M, Pawlina W. Histología: Texto y atlas color con biología celular y molecular. 5a Ed. Buenos Aires: Medicina Panamericana; 2010.
  3. Chan A, Quaglia A, Haugk B, Burt A. Atlas de patología anatómica: Springer.
  4. Chirinos ARR. Parasitologia y zoologia medica. Colección libro de texto Tomo 1: Universidad del Zulia.
  5. Botero D, Restrepo M. Parasitosis humanas.4a Ed. Colombia: Corporación para investigaciones biológicas.
  6. Souza J, Araujo M, Mota D, Da Paixão R, Carvalho E, et al. Monocyte Subsets in Schistosomiasis Patients with Periportal Fibrosis: Mediators Inflamm; 2014
  7. Borim N, Marques S. AStudy of the Granulomatous Responses Induced by Different Strains of Schistosomamansoni. InterdiscipPerspect Infect; 2012.
  8. Barrios E, Tonino P, Hams E, Aviello G, Fallon P. Schistosomamansoni: respuesta celular hepática de ratones Balb/c infectados unisexualmente. Salus; 2006.
  9. Lundy S, Lukacs N. Chuah C, Jones M .Chronic schistosome infection leads to modulation of granuloma formation and systemic immune suppression. Front Immunol; 2013.
  10. Rosales D, Ortiz L. Infecciones parasitarias: Mecanismos de evasión de la respuesta inmune. SABERULA. 200813.
  11. Gryseels B, Polman K, Clerinx J, Kestens L. Human schistosomiasis. Lancet; 2006.
  12. Amaral K, Silva T, Dias F, Malta K, Rosa F, Costa-Neto S, Gentile R, Melo R. Histological assessment of granulomas in natural and experimental Schistosoma mansoni infections using whole slide. PLoS ONE 12(9): e0184696. https://doi.org/10.1371/journal. pone.0184696
  13. Ash, L. Orihel,T. Atlas de Parasitologia Humana 5ta Ed. Buenos Aires: Medicina Panamericana; 2010
  14. Mavarez, J, Amarista M. Fine-scale population structure and dispersal in Biomphalaria glabrata, the intermediate snail host of Schistosoma mansoni, in Venezuela. Molecular Ecology;
  15. Hernández R, Fernández C, Baptista P. Metodología de la investigación, 5a Ed Editorial, México: Mc Graw Hill,; 2010
  16. Palella , Martins. Metodología de la Investigación Cuantitativa» 4a ed, Caracas: FEDUPEL; 2006