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CRISPR/Cas9 como herramienta de edición genética y sus aplicaciones en la salud humana

CRISPR/Cas9 como herramienta de edición genética y sus aplicaciones en la salud humana

Autora principal: Dra. María José Alvarado Rubio

Vol. XVIII; nº 13; 671

CRISPR/Cas9 as a tool for gene editing and human health applications

Fecha de recepción: 06/06/2023

Fecha de aceptación: 05/07/2023

Incluido en Revista Electrónica de PortalesMedicos.com Volumen XVIII. Número 13 Primera quincena de Julio de 2023 – Página inicial: Vol. XVIII; nº 13; 671

Autores:

Dra. María José Alvarado Rubio1, Dra. Daniela Quesada Arguedas2, Dr. Andrés Ramírez Camacho3, Dr. Fabián Sánchez Vargas4, Dra. Natalia Villalta Salgado5

1, 2, 3, 4 y 5 Médico general, egresados de Escuela Autónoma de Ciencias Médicas, UCIMED, San José, Costa Rica.

Resumen

Los CRISPR-Cas9 se definen según sus siglas como repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente inter-espaciadas. Son secuencias clave en los sistemas de defensa bacterianos, y forman la base de la terapia genética conocida como CRISPR / Cas9, encargada de cambiar los genes dentro de los organismos.

Esta tecnología ha revolucionado el mundo de la ingeniería genética debido a su capacidad para resolver las limitaciones que presentan otras técnicas de última generación que han sido desarrolladas. Esta singular herramienta de edición genómica perfecciona potencialmente la eficiencia ya que permite reducir el costo de procesamiento, logra introducir o eliminar más de un gen al mismo tiempo sin ser especie-específico, lo que posibilita su uso en prácticamente cualquier organismo.

Fue a partir de una serie investigaciones desde el 2013 donde fue introducida por primera vez en mamíferos logrando posicionarse como herramienta molecular idónea, por lo que en el siguiente trabajo se explicaran sus ventajas, limitaciones y desafíos identificados hasta hoy. Cabe recalcar que esta técnica experimental no está preparada para aplicarse en humanos, pero se ha desarrollado en diversas células vivas y organismos.

Finalmente, la herramienta de edición del genoma guiada por ARN CRISPR-Cas9 ofrece varias ventajas sobre las demás. Ha demostrado potenciales terapéuticos en líneas celulares o modelos animales para enfermedades infecciosas, enfermedades monogénicas y cáncer. Con el rápido avance de esta tecnología, se está logrando revolucionar la investigación en terapia génica y convertirse en una potencial herramienta para la práctica de la terapia génica humana.

Palabras clave

CRISPR/Cas9, terapia genética, edición genómica, biología molecular, mutaciones génicas.

Abstract

CRISPR-Cas9 is defined by its acronym as clustered regularly interspaced short palindromic repeats. They are key sequences in bacterial defense mechanisms and they form the basis of the gene therapy known as CRISPR/Cas9, which is responsible for changing genes within organisms.

This technology has revolutionized the world of genetic engineering due to its ability to overcome the limitations of other last generation techniques that have been developed. This unique genomic editing tool potentially improves efficiency by reducing processing cost, managing to introduce or delete more than one gene at the same time without being species-specific, making it possible to use it in virtually any organism.

It was introduced for the first time in mammals since 2013 from a series of investigations, managing to position itself as an ideal molecular tool. For this reason, the following work will explain its advantages, limitations and challenges it has followed until today. It should be noted that this experimental technique is not ready to be applied in humans, but it has been developed in various living cells and organisms.

Finally, the CRISPR-Cas9 RNA-guided genome editing tool offers several advantages over the others. It has demonstrated therapeutic potentials in cell lines or animal models for infectious diseases, monogenic diseases, and cancer. With the rapid advancement of this technology, it is succeeding in revolutionizing gene therapy research and becoming a potential tool for the practice of human gene therapy.

Keywords

CRISPR/Cas9, gene therapy, genome edition, molecular biology, gene mutations.

Los autores de este manuscrito declaran que:

Todos ellos han participado en su elaboración y no tienen conflictos de intereses
La investigación se ha realizado siguiendo las Pautas éticas internacionales para la investigación relacionada con la salud con seres humanos elaboradas por el Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ciencias Médicas (CIOMS) en colaboración con la Organización Mundial de la Salud (OMS).
El manuscrito es original y no contiene plagio.
El manuscrito no ha sido publicado en ningún medio y no está en proceso de revisión en otra revista.
Han obtenido los permisos necesarios para las imágenes y gráficos utilizados.
Han preservado las identidades de los pacientes.

Si no incluye toda la información arriba indicada se contactará al responsable de la correspondencia del artículo para que la envíe. El proceso de revisión del trabajo no podrá comenzar hasta que dispongamos de ella.

La información que incluya sobre los autores será eliminada antes de comenzar el proceso de revisión para garantizar el anonimato a lo largo del proceso de arbitraje de los manuscritos.

Introducción

En la actualidad, la terapia genética mediante la edición genómica dirigida es uno de los principales campos en los cuales está enfocada la investigación biomédica; cada día son más importantes los avances en el estudio de la genética humana, con el objetivo de desarrollar posibles soluciones a muchas enfermedades y padecimientos definidos por la genética1. Actualmente se tiene conocimiento de cerca de 10,000 enfermedades hereditarias monogénicas, las cuales afectan a millones de personas por todo el planeta; muchas de estas enfermedades son causadas por mutaciones autosómicas dominantes, es decir que la herencia de una única copia defectuosa del gen responsable puede causar síntomas clínicos significativos2. Por eso, es importante el desarrollo de técnicas que permitan editar y corregir el genoma de células vivas2.

El estudio para ampliar y mejorar las terapias génicas actuales, como CRISPR/cas9 tienen como objetivo ser una solución moderna, efectiva y segura basándose en la tecnología “clustered regularly interspaced short palindromic repeats” CRISPR/Cas9, esta es una herramienta molecular de nucleasas programables utilizada para “editar” el genoma de cualquier célula1. Se han desarrollado más de 2000 ensayos clínicos con el fin de rectificar, reemplazar o eliminar los genes culpables de enfermedades genéticas e inducir mutaciones terapéuticas o protectoras3. Esta herramienta ofrece varias ventajas sobre las convencionales como diseño simple y facilidad de uso3. Por lo tanto, se postula como una futura herramienta rentable y conveniente para diversos fines de edición del genoma como: la corrección de variantes causantes de enfermedades monogénicas, medicina regenerativa y la mejora de la terapia con células T4.

A pesar de que los inicios de la edición genómica dirigida datan del año 1970 y que los avances y descubrimientos actuales parecen tener potencial para desarrollar terapias efectivas, existen aún muchas limitaciones para la aplicación de estas terapias en humanos, ya que su mecanismo es muy complejo y no garantiza resultados efectivos en todos los casos, así como la edición del ADN en células no deseadas lo cual constituye la principal limitación, ya que podría tener implicaciones sumamente graves e incluso mortales en quienes se sometan a la terapia5.             

A partir de esta revisión se pretende analizar el CRISPR/Cas9 y explicar su mecanismo de acción para entender correctamente su función como herramienta de edición genética1. Además, mencionar sus aplicaciones potenciales en terapia celular y genética, así como también sus repercusiones en la salud humana1.

Historia

Como parte de la historia, en el año 1987 se publicó el primer artículo acerca de secuencias repetidas en el genoma de las bacterias, como E. coli y S. pyogenes.6 Inicialmente se pensó que estas secuencias repetidas carecían de función6. Sin embargo, en el año de 1993, Francisco Martínez Mojica de origen español, describió secuencias similares en las bacterias Haloferax mediterranei y otros tipos de bacterias, por lo que decidió llamarlas “short regularly spaced repeats” (SRSRs)7. Dos años después, Ruud Jansen encontró genes asociados a estas secuencias repetidas y con la aprobación de Mojica, renombraron las secuencias a “clustered regularly interspaced short palindromic repeats” (CRISPR)7.

Las similitudes entre los espaciadores asociados a CRISPR y el material genético de ciertos virus que invaden bacterias, fueron identificadas en el año 2005 por Martínez Mojica; fue en ese momento cuando se reconoce el sistema CRISPR como un sistema de defensa de las bacterias.6 Este descubrimiento es la base actual del  desarrollo de la técnica de edición genética. En el 2012, se realizó un primer “corte” con el sistema CRISPR/Cas9 en un tubo de ensayo, por el equipo liderado por Doudna y Charpentier, quienes supusieron que lo mismo se podría realizar en células eucariotas y ser utilizado para edición genética6. En el mismo año, Feng Zhang realiza el primer corte con CRISPR/Cas9 sobre el genoma de una célula de mamífero6.

Mecanismo de Acción

El sistema CRISPR/Cas9 tiene dos componentes: un ARN proveniente de la secuencia CRISPR, llamado “ARNcr” y la endonucleasa Cas8. El ARNcr se obtiene de la actividad del mecanismo de defensa de las bacterias, es decir, el sistema CRISPR8. Está compuesto por secuencias repetitivas palindrómicas separadas entre sí mediante secuencias denominadas “espaciadores” y por delante, una secuencia llamada líder o promotor.1 Cerca de este agrupamiento, se encuentran genes que codifican para un tipo de nucleasas llamados genes CAS (CRISPR associated proteins)8. Dichos componentes se muestran en la figura 19.

Cuando una bacteria es invadida por un patógeno, lo primero que ocurre es que los genes CAS forman un complejo proteico llamado Cas9 que puede transcribir el ADN de las secuencias CRISPR en ARN, a este se le llama “ARNcr”1. El complejo, al entrar en contacto con el material genético del patógeno, destruye al virus8. Además, éstas proteínas Cas son capaces de “cortar” una pequeña parte del ADN patógeno con ayuda tanto del ARNcr, que lo guía hacia la cadena complementaria que debe cortar; y las secuencias PAM (protospacer adjacent motif) que son las secuencias que se encuentran junto al punto de corte, capaces de distinguir el ADN bacteriano del ADN invasor8. Posteriormente, este fragmento es incorporado dentro del conjunto de secuencias CRISPR; de esta forma, si la bacteria vuelve a entrar en contacto con el patógeno, ésta es capaz de reconocer a las moléculas de ADN patógeno y de guiar a la nucleasa Cas9 para que realice el corte para luego eliminarlas10. Este mecanismo de defensa bacteriano se observa en la figura 21.

La capacidad para reprogramar el sistema CRISPR fue desarrollada por Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier y es lo que ha dado lugar a una gran variedad de opciones de potenciales aplicaciones en la edición genética10. Actualmente existen descritos tres diferentes tipos de CRISPR, el I, II y III1. El tipo II es el más estudiado y empleado universalmente1. En este, la endonucleasa Cas se asocia con el ARNcr y forma el complejo CRISPR/Cas, que como se mencionó previamente es el que guía la nucleasa1. Entonces para la edición génica, lo que se hace es que “reprograman” el ARNcr modificando así el objetivo diana de la nucleasa10; para esto, se debe mantener intacta toda la estructura a excepción de los 20-30 nucleótidos que forman la secuencia espaciadora10. Posteriormente, para que el CRISPR sea específico, se debe tener una completa complementariedad entre los nucleótidos de la secuencia espaciadora y el ADN diana, ya que con una tan sola diferencia que se presente, el sistema no funcionará11. Además de esta homología, es esencial el reconocimiento de la secuencia PAM por la nucleasa, ya que de esta manera se une, empareja las bases y produce el corte en el ADN de interés 8.

Esta precisión de cortes sitio-específico ha permitido al CRISPR/Cas adaptarse para insertar, eliminar o generar mutaciones en diferentes secuencias1. Dichas mutaciones pueden ser por medio de la inserción de genes por recombinación homóloga, por deleciones dentro del genoma y por mutagénesis1. La inserción de genes por recombinación homóloga consiste en el corte por medio de la nucleasa y posteriormente la inserción de una secuencia con alta homología por los extremos 3’ y 5’, con esto el CRISPR/Cas puede dirigirse hacia un locus del genoma en células humanas e inducir una reparación con una baja tasa de mutagénesis1. En la deleción dentro del genoma, se realiza el corte por medio de la nucleasa y se generan deleciones de fragmentos grandes en ADN de doble cadena1. Finalmente, en la mutagénesis, se reprograma el ARNcr para una o varias secuencias específicas y con esto, se logra inducir mutagénesis en genes objetivo hasta con una eficiencia del 88%1.

Luego, estos cortes generados por la nucleasa, activan en el genoma la reparación mediante una reparación dirigida homóloga (HDR) o mediante un reparación final no homóloga (NHEJ)4. La vía de reparación preferencial es la NHEJ, cuyo mecanismo consiste en la unión de los extremos rotos, sin la necesidad de un molde homólogo4. Sin embargo, a pesar de esta ruta ser precisa, típicamente puede crear errores, ya que puede introducir mutaciones adicionales al generar inserciones o deleciones en la zona de la unión4. Por otro lado, en la reparación que es la recombinación homóloga (HDR), se introduce un molde de ADN en la célula4. Esta vía puede utilizar como molde la región correspondiente del cromosoma homólogo o una molécula exógena de ADN provista para llevar a cabo la correcta unión de los extremos, ambos procesos de reparación se pueden visualizar claramente en la figura 34,1. En resumidas cuentas, la diferencia entre el HDR y NHEJ es que el primero conduce a una corrección o reemplazo génico preciso, mientras que NHEJ es propenso a errores y puede terminar insertando o eliminando mutaciones4.

Aplicaciones 

Algunas de las aplicaciones que tiene la herramienta de edición del genoma CRISPR incluye la edición génica en protozoos, hongos, plantas, animales (mamíferos) y humanos5. “La corrección de los trastornos monogénicos representa el campo más importante en la terapia génica mediada por CRISPR-Cas9”5. Por ejemplo, en el modelo de ratón de distrofia muscular de Duchenne (enfermedad monogénica ligada a X heredada) la cual se basa en una mutación en el gen DMD y la corrección de cataratas en murinos por el gen Crygc4.

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) pueden modificarse genéticamente in vitro con esta herramienta, para luego diferenciarse en células deseadas por ejemplo en pacientes con β-talasemia3,5 y pacientes con distrofia muscular de Duchenne4.

La inactivación o eliminación del virus oncogénico se logra porque esta herramienta se deriva del sistema inmune nativo bacteriano. Por ejemplo, con el VIH, el CRISPR-Cas9 al mutar los tejidos somáticos, el gen CCR5 (receptor 5 de quimiocina CC) conduce a la resistencia celular a la infección; con la transfección de Cas9 y sgRNAs dirigidos a HPV16 y gen Lacl se logra reducir la carga viral de células cancerosas de cérvix, Linfoma de Burkitt y cáncer de vejiga respectivamente4. Por lo tanto, se puede afirmar que  las aplicaciones de esta herramienta están revolucionando la agricultura, biología, la biotecnología y la medicina5.

Desafíos, limitantes y posibles soluciones en terapia génica

Si bien el sistema CRISPR/Cas9 se postula como una potencial opción de terapia genética la cual revolucionaría la medicina y muchos beneficios, también existen desafíos como la inmunogenicidad, la especificidad y eficacia en la edición genómica terapéutica, ya que son una limitante en la aplicación de este tipo de terapia en personas debido a que sus consecuencias podrían ser mayores que sus beneficios.12 Estos desafíos se traducen específicamente en efectos fuera de células objetivo, ya que una secuencia específica que se quiera modificar puede estar presente en células de otros tejidos no objetivo1,2.

Por eso es necesario encontrar métodos los cuales permitan identificar y caracterizar de manera más completa, los mecanismos y elementos involucrados en la ocurrencia de efectos fuera de objetivo, como podría ser la unión del Cas 9 a secuencias de ADN equivocadas o la escisión errónea de segmentos de ADN, donde puede tener influencia la existencia de similitud entre secuencias.4  Debido a esto se requieren métodos que permitan mejorar la precisión de este sistema como por ejemplo definir y caracterizar el perfil de unión del Cas9 al genoma y cómo interacciona con este y sus distintos componentes, lo cual se encuentra en constante estudio e investigación.4

Actualmente algunos de los métodos desarrollados con el fin de reducir los efectos fuera del objetivo son: la selección de un sitio objetivo que no tenga una secuencia homóloga en el genoma, donde cobra importancia la composición y estructura del ARN guía, el uso de pares de Cas9 nickases, una forma mutada de Cas9 la cual en vez de generar una ruptura de doble filamento, genera una ruptura monocatenaria, lo que aumenta la especificidad del objetivo, utilizar sgRNA fragmentado en 2-3 pares de bases también puede reducir los efectos fuera de objetivo que al ser más corta tiene una tolerancia de desajuste disminuida, usar vehículos de transporte intracelular del CRISPR-Cas9 como el péptido de penetración, que demostró mayor precisión en comparación con el suministro mediado por plásmido y por último realizar una combinación de CRISPR-Cas9 con otra nucleasa como FokI4.

Con el fin de evitar la edición permanente de genes en tejidos no objetivo, se ha desarrollado una posible alternativa que permite terminar con la actividad enzimática de Cas9 una vez completada la modificación terapéutica del ADN deseada, a través la administración de un anti oligonucleótido Cas9 universal que tiene como blanco el sgRNA, capaz de inactivar todas las ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9 y los diferentes componentes que forman parte del complejo; el cual también se podría utilizar de manera profiláctica mediante la pre administración de este anti oligonucleótido selectivamente en tejidos no objetivo y de esta forma evitar la actividad enzimática Cas9 y la edición de ADN en estos tejidos no objetivo13. Esto busca incrementar la seguridad y posibilidad de aplicación clínica de la edición de genes mediante CRISPR-Cas9 en personas, acabando con las barreras actuales13. Los mecanismos en los cuales se basa este tipo de terapia se ejemplifican en la figura 4.13

Otras Terapias Génicas

Existen otros tipos de terapia génica a parte de la CRISPR/Cas9, estas pueden ser de diferentes tipos. La terapia con oligonucleótidos, hace referencia a oligonucleótidos terapéuticos que son 15-30 nucleótidos de largo y está diseñados para complementar a una región específica del ARNm, que codifica a una proteína relacionada con una enfermedad o un ARN regulador e identifica las secuencias que son altamente específicas para ese ARN específico14. La terapia ex vivo trata de aislar las células afectadas, cultivarlas in vitro en un laboratorio y someterlas al proceso de transducción génica; una vez transformadas las células, se vuelven a reimplantar al individuo donante15. Su ventaja es que solo se exponen a la transferencia del gen terapéutico las células afectadas15. Ejemplos: Inmunodeficiencias combinadas graves: deficiencia de adenosina desaminasa (ADA), una enfermedad que generalmente es mortal en la primera infancia, Talasemias y anemia por células16. Por último, la terapia In vivo consiste en introducir el vector con el gen terapéutico directamente al paciente, ya sea por vía sistémica (en infusión), o por inyección directa en el tejido afectado, tal y como se muestra en la figura 516. El problema es que no se logra aislar únicamente en las células deseadas16.  Ejemplos: El tratamiento de una forma rara de ceguera autosómica recesiva causada por mutaciones en RPE65, que codifica una enzima crítica para el ciclo visual.15 Hemofilia, especialmente la B y Atrofia Muscular Espinal16.

Conclusión

Finalmente, se puede decir que el desarrollo del sistema CRISPR a partir de 1987 ha sido de gran utilidad para la terapia génica. Cabe recalcar que su descubrimiento no fue tan certero debido a que el primer artículo que se publicó sólo explicaba las secuencias repetidas en el genoma de las bacterias, como E. coli y S. pyogenes y fue Mojica en 1993 el encargado de definir a estas secuencias como “short regularly spaced repeats” (SRSRs) y es en el año 2013 donde se introdujo por primera vez en organismo mamíferos.

Por otro lado, el mecanismo de edición genómica con CRISPR-Cas9, consiste en una etapa inicial, en donde el ARN guía (sgRNA), es el encargado de dirigir a la endonucleasa Cas9 a cortar el ADN en una región específica seguido de la activación de mecanismos de reparación (mutaciones de inserción o deleción). Sin este proceso mencionado anteriormente, no se podría realizar el recambio de genes en cualquier organismo envuelto en esta técnica.

Este sistema es una herramienta de edición versátil, capaz de corregir mutaciones genéticas como se demostró en enfermedades monogénicas y modular estados epigenéticos. En la actualidad, se aplica en inmunización artificial contra fagos en bacterias y en el estudio del genoma dirigido por ARN. También se ha utilizado en varios ensayos clínicos como el de combinaciones de terapia antiretroviral y eliminación del VIH en ratones vivos; en la supresión de la distrofia muscular; el desarrollo de células madre pluripotentes no detectables por el sistema inmunitario, terapia contra el cáncer, entre otras. Existen otras terapias génicas involucradas en la edición del genoma como los vectores en terapia génica como el virus adenoasociados (AVV), cromosomas artificiales, métodos no virales como oligonucleotidos entre otros.

Si se tuviera que escoger una sola técnica de entre todas las desarrolladas, sin lugar a dudas se escogería CRISPR/Cas9. El impacto científico que ha logrado hoy en día es incuestionable y seguirá aumentando debido a la mejora continua que se pretende realizar en ella. Parte de la comunidad científica que trabaja con el CRISPR/Cas9 desea colocarla como una tecnología altamente precisa y eficaz en el campo clínico y biotecnológico.

Ver anexo

Referencias

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