Efecto bacteriostático y/o bactericida de un producto de la fermentación de Trichoderma reesei sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes

antibacteriano (Ácido Kójico), evaluando la concentración mínima inhibitoria (CMI) contra las bacterias grampositivas y gramnegativas, obteniendo efectos inhibitorios contra doce de las bacterias utilizadas en el estudio.

En el mismo orden de ideas Santamarina y col., en 2002 realizaron un estudio donde evaluaron la actividad antagonista de 70 cepas de hongos contra bacterias, hongos e insecto: Penicillium (32), Aspergillus (30), Fusarium (7) y Trichoderma (1). De los 70 aislamientos ensayados (52,11%) fueron capaces de ejercer un efecto inhibitorio en al menos una de las bacterias analizadas. Los mejores resultados fueron obtenidos por tres Penicillium aislados de oxalicum, una cepa de P. decumbens y un Trichoderma harzianum aislado demostrándose la eficacia de biocontrol de Trichoderma no solo en el medio sino también a nivel atmosférico.

Así mismo Ayala en 2010 demostró que en líneas generales, los peptaiboles presentan actividad antibiótica contra bacterias grampositivas y hongos; de este mismo modo los peptaiboles son una gran familia de péptidos lineales (7-20 aminoácidos) naturales sintetizados por muchos hongos, entre los que Trichoderma destaca como productor.

La presente investigación persigue evaluar el efecto bacteriostático y/o bactericida de un producto de la fermentación de Trichoderma reesei sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes con la idea de buscar compuestos biocontroladores que generen conocimientos para combatir principales agentes causantes de enfermedades transmitidas por la contaminación de alimentos, y contribuir así con el beneficio de la población en general en distintos ámbitos económicos, social, medico- sanitario e industrial.

MATERIALES Y MÉTODOS

La población y muestra estuvo conformada por cepas de Trichoderma reesei (ICTA-12) y Listeria monocytogenes (ATCC 446) provistas por la Unidad de Biotecnología Aplicada (UBA) de la Facultad de Ciencias y Tecnologías (FACYT), de la Universidad de Carabobo y por el Centro Venezolano de Colecciones de Microorganismos respectivamente.

Producción de preinóculos de Trichoderma reesei

Se replicaron cepas de Trichoderma en placas de PDA (Agar de Papa Dextrosa) y se incubaron durante seis días a 25 °C para permitir la esporulación del hongo. Se preparó una suspensión madre de conidios a partir del raspado superficial de una cápsula de Agar PDA con el hongo esporulado. Los conidios se suspendieron en 10 mL de agua destilada con Tween 80 al 0,1% (v/v) ajustando la concentración inicial de los preinóculos a 1 x 108 conidios/mL mediante lecturas en espectrofotómetro. Posteriormente, se inocularon 10 mL de la suspensión de conidios preparada anteriormente en erlenmeyers de 125 mL con 90 mL de medio Luria Broth estandarizado previamente, incubándose a 25 °C con agitación constante (180 rpm) durante seis días. Se realizaron mediciones diarias en espectrofotómetro de la suspensión preparada anteriormente con el objetivo de observar la fase estacionaria mediante una curva de crecimiento que tuvo lugar el día cinco, Se tomaron alícuotas del medio y se centrifugaron a 15000 rpm por 20 minutos (Michanie, 2004). El sobrenadante o producto obtenido fue empleado para la verificación de la acción antimicrobiana.

Preparación del inóculo de Listeria monocytogenes

Se inoculó Listeria monocytogenes en Caldo Tripticasa Soya a 37 °C durante un período de 24 a 48 horas, posteriormente se tomó azadas de las colonias y se preparó el estándar de 0,5 de Mc Farland de BaSO4. Con este procedimiento se garantizó un inóculo inicial de 108 UFC de Listeria monocytogenes.

Determinación del tiempo mínimo de inhibición

Fue realizado midiendo el crecimiento bacteriano, para ello se preparó medios de cultivos de caldo nutritivo y concentraciones del producto de la fermentación de Trichoderma reesei al 0%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% y 100%. Se tomó nueve tubos de ensayo y se dispensó 1,25 mL de caldo nutritivo a cada uno, y se autoclavó a 121 °C durante 15 minutos.

Una vez esterilizados se tomó tubo por tubo y se le agregó 0,75 mL de la suspensión bacteriana de Listeria monocytogenes una vez agregada la suspensión bacteriana se agregó también la suspensión de Trichoderma reesei de acuerdo a la concentración del tubo correspondiente, es decir, 100% 2 mL, 60% 1,2 mL, 50% 1 mL, 40% 0,8 mL, 30% 0,6 mL, 20% 0,4 mL, 10% 0,2 mL, 5% 0,1 mL, el correspondiente 0% no se le agregó la suspensión del hongo (actúa como control), inmediatamente se procedió a activar el cronometró para luego realizar la siembra en placas de petri con Agar PALCAM por cuatriplicado a los tiempo de 2,5 min, 5 min, 10 min, y 15 min respectivamente.

Luego se llevó cada una de las placas previamente rotuladas de acuerdo a su tiempo y concentración a la estufa a 37 ºC durante 24 horas, al transcurrir este tiempo se realizó conteo de colonias utilizando una lámpara y lupa para facilitar el procedimiento. Al tener el número de colonias de cada una de las placas de su correspondiente concentración se realizaron los cálculos necesarios para obtener las UFC de Listeria monocytogenes.

Análisis estadísticos

En todos los casos se realizó estadística descriptiva, determinando el promedio y el error en cada experimento. Los datos presentados fueron analizados utilizando el programa Statistix 7.0. Se evaluaron los supuestos de análisis de varianza, en los casos donde se cumplían estos supuestos se compararon por ANOVA y prueba de Tukey HSD (Honestly Signaficant Difference).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La mayor inhibición del crecimiento de Listeria monocytogenes luego de someterse al contacto con el producto de fermentación de Trichoderma reesei, de acuerdo al Gráfico 1, es el tiempo de 10 minutos, ya que en términos generales es el único que se mantiene relativamente homogéneo según las unidades formadoras de colonias (UFC), en comparación con el resto de los tiempos evaluados, sin embargo, a pesar de que estos presentaron una notable inhibición, su efecto no fue aumentando progresivamente al incrementar la concentración y el tiempo, por el contrario hubo crecimiento variable, lo que hace que se observe resultados relativamente heterogéneos entre sí.

La incongruencia más significativa se puede observar en el tiempo de 5 minutos, donde se aprecia un claro pico representativo a la concentración de 40%, en la que prácticamente no hay inhibición en el crecimiento bacteriano, lo cual no coincide con el resto de las concentraciones de dicho tiempo, las cuales presentan una clara disminución en cuanto al crecimiento bacteriano, situación similar se presenta en el tiempo de 15 minutos, en la