Evaluación del Conjugado Anti IgG humana – FITC en hospitales de las provincias orientales

Evaluación del Conjugado Anti IgG humana – FITC en hospitales de las provincias orientales

Las enfermedades autoinmunes se caracterizan por la alteración de los mecanismos de tolerancia inmunológica, en particular por la producción de anticuerpos que reconocen estructuras o antígenos propios, como por ejemplo, los anticuerpos antinucleares (ANA).

Sandra Rivera Infante. Lic. Ciencias Farmacéuticas. Especialista III en Innovación, Investigación y Desarrollo.
Tec. Juan Francisco Alemán de las Cuevas

República de Cuba. Santiago de Cuba. CIM – LABEX

Índice:

Resumen – Palabras clave
Introducción
Objetivo
Materiales y Métodos
Resultados y Discusión
Conclusiones
Referencias Bibliográficas

Resumen

Las enfermedades autoinmunes se caracterizan por la alteración de los mecanismos de tolerancia inmunológica, en particular por la producción de anticuerpos que reconocen estructuras o antígenos propios, como por ejemplo, los anticuerpos antinucleares (ANA) la mayoría de los laboratorios distribuidos mundialmente utilizan para detectar ANA la técnica de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) que se realiza sobre cortes congelados de hígado o riñón de rata y/o monocapas de células tumorales mantenidas en cultivo (HEP-2) de Crithidia Lucillae.

En el Laboratorio de Anticuerpos y Biomodelos Experimentales (LABEX) se comenzó la investigación del Conjugado Anti – IgG humana -FITC, el mismo se utiliza en la detección de los anticuerpos antinucleares (ANA), su determinación constituye el análisis de primera elección para el diagnóstico del lupus eritematoso sistémico (LES) y de las enfermedades del tejido conectivo. Se evaluaron los lotes de conjugados 2502, 2503 y 2504 en: Hospital provincial de Las Tunas Ernesto Guevara de la Serna, Facultad de Ciencias Médicas, Dpto. de Inmunología en Holguín y Hospital Celia Sánchez Manduley en Manzanillo. Se logró un impacto positivo de la investigación con la demostración del buen desempeño del conjugado anti IgG humana – FITC, frente a pacientes en diferentes instituciones con experiencia en el desarrollo de técnicas inmunológicas.

Palabras clave: ANA, LES, conjugado, anticuerpos, FITC

Abstract

Autoimmune diseases are characterized by altered immunological tolerance mechanisms, in particular for the production of antibodies that recognize there own antigens or structures, such as antinuclear antibodies (ANA) most laboratories distributed on the world used to detect ANA the indirect immunofluorescence (IFI) performed on frozen sections of rat or kidney liver and tumor cell monolayers maintained in culture (HEP-2) of Crithidia Lucilliae.

In the Laboratory of Experimental Biomodels Antibodies (LABEX) began the research of conjugated Anti – human IgG – FITC, this is used in the detection of antinuclear antibodies (ANA), its determination is the first choice analysis of the diagnosis of LES and connective tissue diseases. The conjugates lots 2502, 2503 and 2504 were evaluated on: Provincial Hospital of Las Tunas «Ernesto Guevara de la Serna«, Dept. of Immunology in Faculty of Medicine, Holguin Hospital Celia Sanchez in Manzanillo. The investigation research achieved a positive impact whit the demonstration of the good performance of conjugated Anti – human IgG – FITC, in patients of different institutions with expertise in the development of immunological techniques.

Keywords: conjugated, antibody, FITC, antinuclear antibodies

Introducción

Las enfermedades autoinmunes se caracterizan por la alteración de los mecanismos de tolerancia inmunológica, en particular por la producción de anticuerpos que reconocen estructuras o antígenos propios, como por ejemplo, los anticuerpos antinucleares (ANA). Estos autoanticuerpos se hallan altamente asociados a diferentes enfermedades del tejido conectivo y en algunas ocasiones a enfermedades hepáticas autoinmunes. Si bien existen signos y síntomas característicos de cada una de ellas, hay un grupo de pacientes que comienzan con sintomatología general inespecífica, por este motivo la detección de ANA y la correcta identificación de la imagen puede ser muy útil para definir u orientar hacia una enfermedad en particular.

Actualmente, la mayoría de los laboratorios distribuidos mundialmente utilizan para detectar ANA la técnica de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) que se realiza sobre cortes congelados de hígado o riñón de rata y/o monocapas de células tumorales mantenidas en cultivo (HEP-2) de Crithidia Lucillae. La diferencia entre estos dos tipos de sustratos antigénicos está en la cantidad de antígenos nucleares que tienen y por consiguiente la posibilidad de detectar o no un anticuerpo en el suero del paciente con enfermedad reumática, y /o Lupus Eritematoso Sistémico (LES). Los diferentes autoanticuerpos producen imágenes que pueden diferenciarse entre sí por patrones de tinción, los cuales son:

Periférico: En pacientes con enfermedades del tejido conectivo.
Moteado: Asociado al lupus eritematoso sistémico, enfermedad mixta del tejido conectivo, síndrome de Sjögren, polimiositis o escleroderma.
Nucleolar: En aproximadamente un 50-70% de pacientes con solapamiento de escleroderma y polimiositis/dermatomiositis. Se presenta en hasta un 33% de pacientes con escleroderma sistémica, especialmente con complicaciones renales.
Centromérico: En pacientes con esclerosis sistémica, especialmente en la forma de la enfermedad con implicación cutánea (80%). Ocasionalmente, en otras enfermedades conectivas.

Más de cinco millones de personas en el mundo, en su mayoría mujeres, se enfrentan a un futuro incierto, luchan cada día con las consecuencias discapacitantes que sobre su salud provoca el LES, una enfermedad autoinmune crónica que ocasiona que el sistema inmunitario ataque a los tejidos de su propio organismo y que puede poner en riesgo la vida del paciente. Frente a las posibles apoplejías (accidentes cerebro-vasculares), infartos, dolores discapacitantes y fatiga, manchas cutáneas y otros problemas de salud asociados con esta enfermedad crónica sobre todo en los primeros años de la enfermedad, las personas con LES en todo el mundo se han unido para reclamar el fomento en su investigación, tratamientos más efectivos y seguros y la mejora de los servicios de atención sanitaria. En Cuba se evidencia la mejoría progresiva de las curvas de supervivencia desde la década de 1950 hasta la actualidad. Sin embargo, es significativa la morbilidad producida por diversas manifestaciones de la enfermedad durante su evolución y por los efectos de los tratamientos necesarios para controlarlas.

En el Laboratorio de Anticuerpos y Biomodelos Experimentales (LABEX) se comenzó la investigación del Conjugado Anti IgG humana – FITC, el mismo se utiliza en la detección de los anticuerpos antinucleares (ANA), su determinación constituye el análisis de primera elección para el diagnóstico del LES y de las enfermedades del tejido conectivo.

Objetivo: Evaluar el Conjugado Anti IgG humana – FITC producido en LABEX en hospitales de las provincias orientales.

Materiales y Métodos

Diagrama de producción del Conjugado Anti IgG humana – FITC

 Primera etapa: Obtención del inmunógeno:

1. Extracción de suero humano
2. Purificación de IgG humana

 Segunda etapa: Obtención del suero hiperinmune.

1. Inmunización del biomodelo.
2. Monitorización de la respuesta inmune.
3. Extracción de suero de carnero

 Tercera etapa: Purificación del anticuerpo anti IgG humana.

1. Cromatografía de afinidad con proteína A.
2. Diálisis del anticuerpo con PBS.

 Cuarta etapa: Conjugación del anticuerpo anti IgG humana con FITC.

1. Diálisis del anticuerpo con Buffer Carbonato.
2. Mezcla y purificación del conjugado.

 Quinta etapa: Determinación de la actividad biológica del Conjugado Anti IgG humana – FITC

Evaluación del Conjugado Anti IgG humana – FITC

Se realizó la evaluación del Conjugado Anti IgG humana – FITC mediante el montaje de la técnica IFI sobre láminas de ANA (cortes de hígado de rata) las instituciones participantes fueron Hospital provincial de Las Tunas Ernesto Guevara de la Serna, Facultad de Ciencias Médicas Dpto. Inmunología en Holguín y Hospital Celia Sánchez Manduley en Manzanillo.

Se evaluaron tres lotes del Conjugado Anti IgG humana – FITC en diferentes estados: 2502 formulado como producto final ,2503 puro y 2504 puro en diferentes diluciones. Para los ensayos realizados se usaron sueros de pacientes controles conocidos, positivos y negativos.

Resultados y discusión

Los resultados obtenidos fueron satisfactorios mostrando que el producto cuenta con los requisitos necesarios para su utilización, en el apoyo diagnóstico de enfermedades autoinmunes y su diferenciación en base al patrón expresado por el paciente. Ver tablas 1,2 y 3.

Se observó que la intensidad de la fluorescencia es dependiente fundamentalmente de tres factores de gran importancia: del reactivo conjugado, del microscopio usado, así como del estado técnico del mismo. Esto se debe a que cada conjugado tiene una concentración diferente en su estado puro el cual se logra estandarizar en el proceso de formulación en base a su actividad biológica donde se define la dilución optima del producto formulado, la influencia del microscopio usado está en que en dependencia de la lámpara de fluorescencia que presente puede tener mayor o menor intensidad de fluorescencia con respecto a otras marcas comerciales, del estado de conservación y de la limpieza del microscopio dependerá su visibilidad, porque los filtros que este equipo contiene en su interior son susceptibles al ataque de microorganismo.

Tabla 1. Resultados del Conjugado Anti IgG humana – FITC obtenidos en Las Tunas.

Tabla 2. Resultados del Conjugado Anti IgG humana – FITC obtenidos en Holguín.

Tabla 3. Resultados del Conjugado Anti IgG humana – FITC obtenidos en Manzanillo.

Conclusiones

1. Se logró un impacto positivo de la investigación con la demostración del buen desempeño del Conjugado Anti IgG humana – FITC, frente a pacientes en diferentes instituciones con experiencia en el desarrollo de técnicas inmunológicas.
2. Las instituciones participantes mostraron interés en la adquisición del reactivo conjugado para el mantenimiento del servicio a pacientes con sospecha de enfermedades autoinmunes.

Referencias Bibliográficas

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4. Anticuerpos Anti-Nucleares Una Familia Diversa*Laboratorio En La Practica Clênica. Carlos A. Javier-Zepeda*Rev Med Hond 2002; 70:189-193
5. Uso Del Laboratorio Reumatológico. Dra. Verónica Mezzano Revista Colombiana De Reumatología. Print Version Issn. 0121-8123.
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7. Sistema De Detección Selectiva De Anticuerpos Ana Relisa®.Para El Uso Profesional Número De Catálogo: 7096-11 (96 Pocillos) Y 7696-11 (576 Pocillos
8. Utilización Y Valor Predictivo De La Determinación De Anticuerpos Antinucleares En Un Hospital De Referencia Nacional De Salud. Dra. Elena Kokuina, 1 Dra. Araceli Chico, 2 Dr. Miguel Estévez, 2 Dr. Dionisio Pérez, 3 Dra. Ángela Gutiérrez 4 Y Dr. Celso Cruz 5
9. Obtención De Un Conjugado Anti Igg De Ratón – Fitc Mediante La Tecnología Igy Para Uso Como Anticuerpo Secundario En La Detección De Antígenos. De Superficie Celular. Esteban J. Gutiérrez Calzado, Tomás Samón Chávez, Alejandro Miranda Ariza, George Fernández Duarte, David Higginson Clarke,* Gustavo Sierra González** Y Rüdiger Schade.***Laboratorio De Anticuerpos Y Biomodelos Experimentales, Instituto Superior De Ciencias Médicas, Santiago De Cuba. *Departamento De Biología Molecular, Dirección De Neurociencia