Presentación de una nueva técnica de elaboración propia, manual y automatizada, ultrasensible y cuantitativa, para la determinación de sangre oculta en hemorragias digestivas altas y bajas, en orina y en otros líquidos biológicos
RESUMEN:
Los métodos para investigar sangre oculta pueden ser químicos o inmunológicos. Los primeros tienen mala sensibilidad y especificidad, pero sirven para evaluar hemorragias digestivas altas y bajas. Los segundos son muy sensibles y específicos pero detectan únicamente sangrados colorrectales. Algunos de estos últimos tienen la ventaja indudable de ser cuantitativos. Se presenta un método químico de excelente sensibilidad y especificidad, ultrasensible y cuantitativo, basado en el método cromogénico de la 4-aminofenazona.
Presentación de una nueva técnica de elaboración propia, manual y automatizada, ultrasensible y cuantitativa, para la determinación de sangre oculta en hemorragias digestivas altas y bajas, en orina y en otros líquidos biológicos
Lautaro Fidel Bracco, Bioquímico de la Universidad de Buenos Aires (UBA). Becario Doctoral de CONICET. Doctorando de Ingeniería de Procesos Industriales y Biotecnología. Asesor de Investigación y Desarrollo de Procesos del Laboratorio Gamma Nuclear.
Malco Fidel Benjamin Bracco. Técnico Universitario en Ciencias Experimentales. Estudiante avanzado de Licenciatura en Ciencias Químicas de la Universidad de Belgrano, de la ciudad autónoma de Buenos Aires. Pasante del Laboratorio Gamma Nuclear.
José Luis Bracco, Bioquímico, Master en Nutrición y Biotecnología Alimentaria de la Universidad Europea Miguel de Cervantes. Jefe del Laboratorio Gamma Nuclear, Galarza 1082/86, Concepción del Uruguay, Argentina.
PALABRAS CLAVE: sangre oculta, hemorragias digestivas altas y bajas, método cromogénico cuantitativo, -4 aminofenazona.
- INTRODUCCIÓN Y ESTADO DEL ARTE:
Los métodos que usualmente se emplean para la determinación de sangre oculta en materia fecal, pueden ser químicos o inmunológicos. Los métodos químicos se basan en la habilidad peroxidasa símil de la hemoglobina y del grupo hem, de oxidar un reactivo cromogénico en presencia de peróxido de hidrógeno, desarrollando color.
El método de la ortotoluidina se basa en la actividad peroxidasa de la hemoglobina, o de oxidantes no específicos, de catalizar la reacción del peróxido de hidrógeno y el cromógeno ortotoluidina, para formar o-toluidina oxidada de color azul. Es más sensible que el método clásico, reaccionando con mínimas cantidades de sangre, o de peroxidasas y otros agentes oxidantes, por lo que produce muchos falsos positivos, lo cual le otorga un gran valor a los test negativos como diagnóstico de ausencia de sangrado intestinal. El método del guayacol, por el contrario, tiene una sensibilidad baja lo que le concede valor a las pruebas positivas, que denotan la existencia de sangrado intestinal. El HemoQuant se basa en la detección de derivados porfirínicos de la hemoglobina. Es más específico que el método del guayacol.
Los métodos que usan la reacción de la peroxidasa tienen la gran ventaja de ser económicos y de evaluar hemorragias digestivas altas y bajas, pero tienen como desventajas la baja sensibilidad y la baja especificidad, con resultados falsos negativos y falsos positivos.
Los métodos más modernos, de tipo inmunológico, como la aglutinación inmunoquímica de látex, la inmunodifusión radial simple y la hemoaglutinación reverso pasiva, han sido métodos más sensibles a las concentraciones bajas de hemoglobina humana en heces. Los estudios clínicos indican que los resultados de la prueba son positivos, únicamente, en 50 a 60% de pacientes con cáncer colorrectal y, solamente, en 25 a 30% de pacientes con pólipos. Por lo tanto métodos mejores y más sensibles para detectar sangre oculta fecal son importantes para el diagnostico de enfermedades que dan lugar a sangrado gastrointestinal.
La inmunocromatografía rápida, comercializada también como Hemosure iFOB y otras marcas, revela niveles inferiores de sangre oculta fecal empleando un método inmunoespecífico de captura del doble sandwich. Los resultados positivos pueden ser vistos si los niveles de hemoglobina en las heces son tan bajos como 0.05 µg Hb/ml, es decir 50 ng de Hb/ml.
La prueba Hemosure iFOB es específica para hemoglobina humana. La hemoglobina de caballo, cerdo, pez, res, gallinas, conejos, ratas, cabras y ratones no reaccionan con esta prueba. La muestra fluye a través del dispositivo absorbente; el anticuerpo, marcado con un colorante, se conjuga con la hemoglobina de la muestra y forma un complejo antígeno-anticuerpo. Este complejo enlaza al anticuerpo anti-hemoglobina en la zona de reacción positiva de la prueba y produce una banda de color rosado. En ausencia de hemoglobina, no hay línea en la zona de reacción positiva de la prueba. Los extractos acuosos de melón, coliflor, nabo, rábano, jícama, y 20 mg/ml de solución de peroxidasa, no interfieren en el resultado.
La desventaja de estos métodos inmunológicos reside en que reaccionan contra la molécula de hemoglobina íntegra y, por lo tanto, no evalúan hemorragias digestivas altas; únicamente pueden ser empleados cuando se sospecha sangrado colorrectal.
Presentamos en este trabajo un método automático y manual, ultrasensible y cuantitativo, de elaboración propia, que determina la cantidad de sangre oculta en hemorragias digestivas altas y bajas, en µg de Hb/ml y en ng de Hb/ml, con una sensibilidad similar o mayor que los métodos inmunológicos; basado en el método cromogénico de la 4-aminofenazona.
- MATERIALES
Reactivos:
- Reactivo 1: 4- aminofenazona (4-AF) 25 mmol/l en buffer TRIS 0.92 mol/l
- Reactivo 2: Fenol, 55 mmol/l
- Reactivo 3: Peróxido de hidrógeno de 2 volúmenes
- TÉCNICA
- Diluir la materia fecal en agua destilada: un pitsk