(pizca) o knifepoint (punta de cuchillo) de materia fecal en 10 ml de agua
- Agitar 5 minutos en agitador
- Centrifugar a 3000 r.p.m.
- Usar el sobrenadante
Si el sobrenadante no es límpido o presenta alguna coloración puede ser necesario añadir un Blanco de Muestras, con 50µl del sobrenadante más un mililitro de agua destilada.
Técnica Manual:
Ver: Tablas – determinación de sangre oculta, al final del artículo
Leer el color magenta producido en espectrofotómetro a 505 nm.
Corregir las lecturas del desconocido y del estándar restándoles la lectura del blanco.
Resultado:(Hemoglobina del Estándar en mg/dl x Lectura del Desconocido) % Lectura del Estándar
Técnica Automática:
- Reactivo 1: reactivo 4-AF 1:50 + reactivo de fenol 1:50
- Reactivo 2: agua oxigenada de 2 volúmenes
- FICHA TÉCNICA DEL AUTOANALIZADOR:
- TIPO: Color
- REFERENCIA: Factor
- LONGITUD DE ONDA: 505 nm
- UNIDADES: µg/ml o ng/ml
- VOLUMEN MUESTRA: 100 µl
- VOLUMEN 1º REACTIVO: 200 µl
- VOLUMEN 2º REACTIVO: 100
- 1º INCUBACIÓN: 10 MINUTOS
- LIMITE INFERIOR: 0
- LIMITE SUPERIOR 2560
- BL//L.SUSTRATO: 0.150
- TESTIGO: 129 µg/ml
- FACTOR: 1100
Sensibilidad: La sensibilidad es del orden de 25 a 40 ng de Hb/ml
Sensibilidad de otros métodos:
- Inmunológico: 200 ng Hb/ml
- Inmunocromatográfico: 50 ng Hb/ml
El presente método es cuantitativo, en sus versiones manual y automatizada, como los mejores métodos automáticos existentes en el mercado, considerados en la actualidad los procedimientos gold estándar de la investigación de sangre oculta; aunque aventaja a dichos métodos en la posibilidad de valorar hemorragias digestivas altas y bajas.
En los métodos automáticos cuantitativos de Fecatest por aglutinación de partículas de látex, el rango de detección va de 0 a 1200 ng Hb/ml de buffer. Esto permite predeterminar el punto de corte para un resultado positivo, que se ha fijado en 100 ng Hb/ml que es lo recomendado por los fabricantes.
En el método que presentamos el rango de detección va desde 0 a más de 1280 µg Hb/ml, y la sensibilidad es del orden de 25 a 40 ng Hb/ml. El punto de corte se ha fijado en 45 ng de Hb/ml.
- RESULTADOS:
- EN OTROS LÍQUIDOS BIOLÓGICOS: Se estudió la performance del método en muestras de orina sospechosas, sin centrifugar, usando como estándar una dilución 1:1000 de sangre de hemoglobina valorada o conocida, y como estándar interno el número de hematíes del sedimento.
Ver: Tablas – determinación de sangre oculta, al final del artículo
En consecuencia:
- Los valores esperados para el sangrado macroscópico son > 120 µg de Hb/ml.
- Los valores esperados para el sangrado microscópico (oculto) son < 120 µg de Hb/ml.
- La mínima lectura capaz de resolver el método es de 42 ng/ml, equivalente a una suspensión que, centrifugada, arroja un resultado del sedimento de 6 hematíes por campo 400x. (Gráfico nº1, anexo)
4.2. EN MATERIA FECAL NORMAL: Un paciente joven, normopeso, clínicamente normal, sin signos de sangrado gastroentérico, sometido durante 3 días a una dieta con sobrecarga de carnes rojas, verduras verdes, y a cepillado dental habitual, arrojó el siguiente resultado de la sangre oculta en la primera materia fecal del cuarto día, con continuación de la dieta.
Lectura del desconocido: 0.128
Lectura del blanco de reactivos: 0.014
Lectura del blanco de muestra: 0.112
Lectura del desconocido – (Lectura del blanco de reactivos + Lectura del blanco de muestra) = 0.128 – 0.126 = 0.002
Desconocido = 0.002 X 10.66 = 0.0213 µg/ml = 21.3 ng/ml
Donde 10.66 es el Factor en esa zona de la curva.
El punto de corte se fija en 2 veces el valor obtenido en un paciente normal, sin restricciones dietéticas, con el propósito de descartar algún eventual falso positivo, entonces:
- Negativo: < 45 ng/ml
- Positivo débil: 45-90 ng/ml
- Positivo: > 90 ng/ml
4.3. EN EXTRACTOS VEGETALES: Se evaluó la utilidad del método para determinar peroxidasa en extractos vegetales, de importancia para encontrar fuentes de enzima para fines biotecnológicos. Es conocida la peroxidasa del rábano (horseradish peroxidase o HRP), que tiene grandes aplicaciones en técnicas inmunoquímicas y de diagnóstico clínico debido a su gran estabilidad, facilidad de conjugación con las inmunoglobulinas y sencillez para ser detectada por métodos colorimétricos utilizando un gran número de reactivos como fenoles, aminas aromáticas, moléculas orgánicas complejas como el ABTS ó 2,2′-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ioduro y glutatión.
Se utilizó un extracto acuoso de harina de soja (50% p/v), el cual arrojó el siguiente resultado:
Lectura del extracto: 0.090
Lectura del blanco: 0.014
Factor en esa zona de la