la uretritis gonocócica en hombres, dada su alta sensibilidad y especificidad(30). Empero, la interpretación de frotis coloreados por Gram de muestras endocervicales y rectales se considera difícil, debido a la presencia de bacterias que interfieren con la observación del gonococo o semejan diplococos, como sucede con los cocobacilos Gram negativos Moraxela osloensis, Moraxela phenylpyruvica, Kingella denitrificans y Acinetobacter spp. Por lo tanto, no es recomendable, por la baja sensibilidad y especificidad (31).
INFECCIONES DEL TRACTO URINARIO
Las infecciones del tracto urinario (ITU) se hallan entre las enfermedades infecciosas más frecuentes. Denotan una amplia variedad de entidades patológicas, en las cuales el común denominador es la presencia de un número significativamente grande de microorganismos en cualquier porción del aparato urinario. Se han diseñado numerosos métodos para determinar bacteriuria significativa además del urocultivo: microscópicos, químicos, bioquímicos, enzimáticos, etc., pero un número mínimo logra ofrecer un costo adecuado y sencillez en la realización del análisis (32).
La coloración de Gram se ha empleado como prueba de tamización en el diagnóstico de la infección del tracto urinario (ITU). La técnica utilizada en la mayoría de los laboratorios y estudios es la de la orina total sin centrifugar, en la cual se considera como criterio de positividad el hallazgo de una o más bacterias por campo de inmersión, lo cual se ha correlacionado con urocultivos con más de 10^5 UFC/mL. La sensibilidad y especificidad de esta prueba varían del 65% al 94%, y del 75% al 98%, respectivamente (33, 34). Por su lado, Villarroel demostró que la tinción de Gram para el diagnostico de bacteriuria tiene una sensibilidad y especificidad del 93% y 98% respectivamente (35).
La principal ventaja de realizar el Gram de orina no centrifugada como parte de la rutina bacteriológica de cultivos de orina, es el diagnóstico presuntivo rápido de infección urinaria y como guía para el tratamiento inicial basado en la forma y propiedades de la tinción del probable agente etiológico. En resumen, la gran rapidez y simplicidad de la coloración de Gram de orina no centrifugada permiten detectar con alto rango de sensibilidad y especificidad la presencia de bacteriuria significativa compatible con infección del tracto urinario (36); además, es un método rápido, económico, sensible y específico para detectar bacteriuria. Se recomienda realizarlo como respaldo frente a discordancias o hallazgos especiales más que como screening. Debe aplicarse a la muestra recién agitada sin centrifugar. La presencia de una bacteria/campo de inmersión tiene buena correlación con un recuento mayor de 100.000 ufc/ml en aproximadamente 85% – 95% de los casos (37). Sin embargo, la tinción de Gram de una muestra de orina no se utiliza en la mayoría de los laboratorios clínicos como prueba de cribado porque la revisión metódica de los frotis es demasiado arduo.
ESPUTO
La tinción de Gram también es de gran utilidad para evaluar las muestras de esputo. Teniendo en cuenta el número de células epiteliales escamosas y de neutrófilos segmentados, Barlett en el año 1974(38), ideó un sistema en el cual se le asignan puntos negativos a un frotis que contenga células epiteliales escamosas, parámetro que indica la contaminación con secreción orofaríngea (saliva).
Cuando se observan la presencia de neutrófilos se le asigna una puntuación positiva, que indica la presencia de inflamación activa. Posteriormente Murray y Washington propusieron un sistema similar y consideraron clínicamente relevantes las muestras que presentaran menos de 10 células epiteliales y más de 25 leucocitos polimorfo nucleares neutrófilos por campo de bajo poder(39). Aunque este sistema de graduación de esputos está clínicamente aceptado para muestras de secreciones respiratorias obtenidas por expectoración espontanea, no puede aplicarse si se sospecha infecciones pulmonares causadas por micobacterias, la mayoría de hongos, especies de Legionella y virus. Además, el significado de la presencia de neutrófilos se altera en algunas situaciones:
1) cuando el paciente está neutropénico a causa de una enfermedad o tratamiento,
2) cuando el paciente no presenta una respuesta inflamatoria eficaz y
3) cuando un cuerpo extraño causa irritación de la superficie de la mucosa (1),por lo tanto, los resultados de la coloración deberían ser correlacionada con la historia clínica del paciente.
BACTERIAS ANAEROBIAS
En la identificación de anaerobios, la tinción de Gram es de una gran utilidad como diagnóstico presuntivo, ya que proporciona información acerca de los tipos de bacterias existentes, cantidad relativa de las mismas, presencia de leucocitos, etc. Por ejemplo, Bacteroides, por lo general, aparecen como bacilos pleomórficos que se tiñen débilmente con la tinción de Gram; las formas cocobacilares son sugestivas de especies pigmentadas de Prevotella o Porphyromonas. Fusobacterium nucleatum suele presentarse como un bacilo Gram negativo fino y fusiforme y a menudo dispuesto en parejas, unidos por un extremo.
La presencia de pequeños cocos gramnegativos son indicativos de Veillonella. Los bacilos grampositivos anaerobios adoptan múltiples formas y pueden aparecer grampositivos o «gramvariables». Las esporas de Clostridium se ven raramente en las tinciones de los exudados. Un bacilo grampositivo grueso, de forma rectangular y sin esporas es sugestivo de Clostridium perfringens. Un bacilo grampositivo ramificado es sugestivo de Actinomyces o Propionibacterium. Para establecer un diagnóstico presuntivo de una infección por anaerobios es importante que el microbiólogo correlacione el origen de la muestra con los morfotipos observados en la tinción de Gram.
Por otra parte, esta tinción es un elemento importante para el control de calidad del laboratorio. Si no se consigue aislar todos los morfotipos observados esto puede ser debido, probablemente, a algún fallo en los distintos pasos del diagnóstico de los anaerobios (recolección de la muestra, transporte o procesamiento), o bien se trata, aunque es menos común, de una inhibición del microorganismo por un antibiótico residual (40).
LÍQUIDO ARTICULAR
El estudio microbiológico del líquido articular incluye: la tinción de Gram y la siembra en medios de cultivo convencionales con incubación aerobia y anaerobia. La coloración de Gram proporciona una información útil e inmediata en relación con el diagnóstico y la orientación del tratamiento. En ocasiones, puede ser el único dato de infección cuando se debe a organismos exigentes que no son capaces de crecer en el cultivo. A pesar de su utilidad, la sensibilidad y especificidad de la tinción de Gram no están bien definidas.
En la artritis bacteriana no gonocócica, se estima que la sensibilidad oscila del 29% al 50% (máxima sensibilidad en la infección por S. aureus). En la artritis gonocócica, la sensibilidad es mucho más baja, probablemente menor al 10%. Por el contrario, la especificidad es siempre muy elevada (41). De lo anteriormente referenciado, se puede concluir que esta tinción junto con el hemocultivo, deben ser considerados como métodos de gran aporte en la confirmación microbiológica de las infecciones osteoarticulares (42).
SISTEMA NERVIOSO CENTRAL
En el diagnostico de las infecciones bacterianas del sistema nervioso central, la tinción de Gram del líquido cefalorraquídeo (LCR) permite una identificación bacteriana rápida y precisa en el 60%-90% de los pacientes con una meningitis bacteriana y presenta una especificidad del 97% (1). La probabilidad de que se visualice algún microorganismo mediante esta tinción se correlaciona con la concentración bacteriana en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Una concentración de 103UFC/ml se asocia a un 25% de positividad de la tinción de Gram. Una concentración de 103-105 UFC/ml se asocia a un 60% de positividad y una concentración mayor de 105 UFC/ml se correlaciona con el 97% de casos con tinción de Grampositiva. La probabilidad de que esta tinción sea positiva depende también del tipo específico de bacteria que cause la meningitis. S. pneumoniae se observa en el 90% de casos, H. influenzae en el 86%, Neisseria meningitidis en el 75%, bacilos Gram negativos en el 50% y aproximadamente en un tercio de los casos de meningitis causadas por Listeria Monocytogenes se observan bacilos Grampositivos (43). Por su lado, Baines afirma que la tinción de Gram de líquido cefalorraquídeo (LCR) permite identificación del agente etiológico en aproximadamente 60 a 90% de los casos de meningitis bacteriana y en el caso de meningococo esta tinción evidencia reacción leucocitaria y diplococos Gram negativos intra o extracelulares (44).
Algunos autores consideran que la tinción de Gram puede ser más sensible que las técnicas de detección de antígenos (prueba de aglutinación por látex) y que, por ello, esta tinción debe realizarse siempre (45). Aunque la tinción de Gram es un método rápido, barato y específico para el diagnóstico de las meningitis, en los pacientes que han recibido tratamiento antibiótico previo, la sensibilidad de esta tinción puede disminuir en un 20%(43).Maxson y cols. indican que un tratamiento antibiótico oral o parenteral de menos de 24 horas de duración antes de la realización de la punción lumbar, no da lugar, necesariamente, a una tinción de Gram del líquido cefalorraquídeo (LCR) negativa(46).
Para finalizar, a la coloración de Gram se le han hecho algunas modificaciones (Hucker, Atkin, Kopeloff) que permiten visualizar ciertos microorganismos Gram negativos que se tiñen débilmente con el colorante de contraste, como lo son el Campylobacter sp, Legionella sp, Brucella sp, y algunos anaerobios. De otro lado, están los famosos gramvariables, que son tinciones de difícil interpretación cuando son realizadas a partir de cultivos axénicos, ya que las células observadas se verán al mismo tiempo como Grampositivas y Gram negativas. Extendidos muy delgados o muy gruesos, coloraciones realizadas antes de las 18 horas o después de las 24 de incubación, inadecuada decoloración, sobrecalentamiento al fijar por calor o lavado excesivo durante la coloración son errores que conllevan a obtener coloraciones gramvariables (9). Por lo tanto, se debe tener un control de calidad riguroso y un buen entrenamiento del personal, parámetros que conllevaran al diagnostico presuntivo de algunos patógenos con esta importante coloración.
CONCLUSIONES
A pesar que la tinción de Gram es un procedimiento sencillo, se debe tener cuidado en la preparación e interpretación de los frotis ya que esta tinción puede presentar algunas *trampas* clásicas que pueden conducir a posibles errores. Por ejemplo, el S. pneumoniae se presenta como diplococos grampositivos en forma de lanceta, puede ser interpretado como una mezcla de microorganismos ya que una variante en su presentación lo hace aparecer como cocos alargados semejantes a bacilos cortos. Las especies de Acinetobacter habitualmente son cocobacilos gramnegativos pero puede observarse también como diplococos gramnegativos confundiéndose con especies de Neisseria. El Clostridium perfringens tiene su presentación clásica como bacilos Grampositivos en forma de tándem pero puede tener la variante de presentación con forma de bacilos Gram negativos o con tinción gramvariable pudiéndose confundir con bacilos Gram negativos; la forma de vagón es un indicio de que el microorganismo es Grampositivo, otros clostridios y las especies de Bacillus también pueden aparecer en forma similar (1).
Dado que la coloración de Gram es uno de los procedimientos más sencillos y de mayor utilidad empleados en la microbiología diagnostica, siempre será necesario correlacionar los hallazgos encontrados en el frotis coloreado con los aislamientos bacterianos realizados de los cultivos, de otro modo se podría caer en contaminaciones y grandes errores que no se ajustan a la realidad del paciente (12).
En la actualidad, esta tinción es la prueba de laboratorio de microbiología más simple y con el mejor costo efectividad, lo que representa un beneficio tanto para el paciente como para el clínico y el laboratorio. A pesar de su gran utilidad, este método debe ser valorado con precaución, ya que la reacción puede variar según la edad de las células (cultivos viejos de bacterias Grampositivas pueden perder capas de peptidoglucanos y teñirse como Gram negativos) y la técnica empleada (al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias Grampositivas se tiñan como gramnegativas); por esta situación debe realizarse un riguroso control de calidad de la coloración utilizando bacterias ATCC Grampositivas y Gram negativas como el S. aureus ATCC 25923 y la Escherichia coli ATCC 25922 cada vez que esta se realice.
BIBLIOGRAFÍA
1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. Diagnóstico microbiológico. Texto y atlas color. Ed. 6ª. Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana; 2008.
2. W, lederman D. En los 500 años del descubrimiento: “colones” y “pinzones” de la microbiología. Rev Chil Infect Edición Aniversario 2003; 18-20.
3. Gram H C. Uber die isolierte Farbung der Schizomycetes in Schnitt und Trocken praparaten. Fortscher Med 1884; 2 (6): 185-9.
4. Thoint L H, Masselin E J. Précis de Microbiología. G Mason et fils, Paris 1889; 148.
5. Santiago, Axel Rodolfo. Hans Christian Joachim Gram. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2003, vol.23, n.2 pp. 200-201.
6. Dominio bacterias. La pared celular. Disponible: //http://www.virtual.anal.edu.co/cursos/ciencias/.
7. Teresa S. Diferencia entre la pared celular de los grampositivos y gramnegativos. 2005. Fecha. 31 julio 2012. Disponible: http://www. Wikilearning.com/dfiferencias_entre_la_ pared_celular_bacteriana.
8. Castillo JL. Las tinciones. Tinción de Gram. Monografía. Fecha: Julio 20/2007.disponible: www.monografias.com/trabajos/tinciones/.
9. Agudelo Clara Inés, Castañeda Elizabeth. Coloración de Gram. Instituto Nacional de Salud. Grupo de Microbiología. 1998. pp. 5-8.
10. Díaz P. et al. Utilidad de la citocentrifugación en el diagnóstico bacteriológico microscópico de fluidos corporales. Rev. chil. infectol. 2002, vol.19, n.3 pp. 167-173.
11. Chapin-Robertson K, Dahlberg S E, Edberg S C. Clinical and laboratory analyses of cytospin-prepared gram stains for recovery and diagnosis of bacteria from sterile body fluids. J Clin Microbiol 1992; 30: 377-80.
12. Cisternas Osvaldo. La tinción de Gram como herramienta de uso diario en el diagnostico precoz de algunos patógenos. Revista del hospital del niño. Panamá Vol. Nro 2. Diciembre 2007.
13. García PJ. Vaginosis bacteriana. Revista peruana de ginecología y obstetricia. vol 53 no 3 julio-setiembre 2007.
14. Aznar J, Martín M., Blanco A., Galán J., Lepe A., Jiménez L., Otero G., Vázquez V. Diagnóstico microbiológico de las infecciones de transmisión sexual y otras infecciones genitales. Procedimientos en microbiología clínica. 2007. Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica.
15. Navarrete W, Paola; Domínguez Y, Mariana; Castro I, Erica y Zemelman Z, Raúl. Evaluación de los criterios de Nugent y Amsel para el diagnóstico de vaginosis bacteriana. Rev. méd. Chile. 2000, vol.128, n.7 p. 767-71.
16. Hernández, Francisco y Moraga, Manuel. Valor diagnóstico de la tinción de Gram en las vaginosis bacterianas. Rev. costarric. cienc. méd. 1997, vol.18, n.1 pp. 49-58.
17. Martínez, María Angélica et al. Comparación de los criterios de Nugent y Spiegel para el diagnóstico de vaginosis bacteriana y análisis de los resultados discordantes por el método de Ison y Hay. Rev. méd. 2011, vol.139, n.1, pp. 66-71.
18. Alisbeth Fuenmayor-Boscán, América Paz-Montes, Alexis Fuenmayor-Boscán, Noris Acosta Morán. Diagnóstico clínico presuntivo versus diagnóstico microbiológico en mujeres con leucorrea .Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología 2009; 29:26-33.
19. López Abraham, Ana María et al. Evaluación de un método de aglutinación con partículas látex sensibilizadas para el diagnóstico de Gardnerella vaginalis. Rev Cubana Med Trop. 2008, vol.60, n.2. pp. 0-1.
20. Nugent RP, Krohn MA, Hillier SL. Reliability of diagno¬sis bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation. J Clin Microbiol 1991; 29(2):297-301.
21. Schwebke J, Hillier S, Sobel J, Mcgregor JA, Sweet RL. Validity of the vaginal Gram stain for the diagnosis of bacterial vaginosis. Obstet Gynecol 1996; 88: 573-82.
22. Martínez T., María Angélica et al. Vulvovaginitis en la adolescencia: estudio etiológico. Rev. Chil. obstet. ginecol. 2003, vol.68, n.6. pp. 499-502.
23. Vera C., López B., Arámbula A. Validez y reproducibilidad del sistema de puntuación de nugent para el diagnóstico de vaginosis bacteriana en mujeres embarazadas. Rev. Chil obstet ginecol 2009; 74 (5).
24. Culhane J, Desanto D, Goldenberg R, McCollum K, King F, Guaschino S. Variation in Nugent score and leukocyte count in fluid collected from different vaginal sites. Obstet Gynecol 2005; 105:120-3.
25. Eriksson K, Forsum U, Bjornerem A, Platz-Christen¬sen J, Larsson P. Validation of the use of Pap-stained vaginal smears for diagnosis of bacterial vaginosis. APMIS 2007; 115:809-13.
26. Amsel R, Totten PA, Spiegel CA et al. Nonspecific vaginitis: diagnostic criteria and microbial and epidemiological associations. Am J Med 1983; 74: 14-22.
27. Fosch, S. et al. Vulvovaginitis: correlación con factores predisponentes, aspectos clínicos y estudios microbiológicos. Rev. argent. microbiol. 2006, vol.38, n.4 pp. 202- 205.
28. Lillo E., Lizama S., Medel C. y Martínez T. Diagnóstico de vaginosis bacteriana en un consultorio de planificación familiar de la región metropolitana, chile. Rev Chil infect 2010; 27 (3): 199-203.
29. Manavi K, Young H, Clutterbuck D. Sensitivity of microscopy for the rapid diagnosis of gonorrhoea in men and women and the role of gonorrhea serovars. Int J STD AIDS. 2003; 14: 390-394.
30. Unemo M, Savicheva A, Budilovskaya O, Sokolovsky E, Larsson M, Domeika M. Laboratory diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in St Petersburg, Russia: inventory, performance characteristics and recommended optimisations. Sex Transm Infect. 2006; 82: 41-44.
31. Lai-King Ng, Martin I. The laboratory diagnosis of Neisseria gonorrhoeae. Can J Infect Dis Med Microbiol. 2005; 16:15-25.
32. Pezzlo M, York MK. Urine cultures. En: Isenberg HD, ed. Clinical Microbiology Procedures Handbook, 2ª ed. Washington: American Society for Microbiology; 2004. p. 3.12.1–12.31.
33. Cardona VillarroeL, Ninoska, Rojas Agreda, Carlos y Zabalaga Salcedo, Lilian. Leucocituria y tinción de gram para el diagnóstico de infección urinaria. Rev. bol. ped., jun. 2008, vol.47, no.2, p.81-85. ISSN 1024-0675.
34. López Vargas, Jaime Alberto et al. Utilidad del citoquímico y la coloración de Gram en muestras de orina en el diagnóstico de las infecciones del tracto urinario en pacientes hospitalizados. 2005, vol.18, n.4 p. 377-384.
35. Villarroel N., Agreda C., Salcedo L. Leucocituria y tinción de Gram para el diagnóstico de infección urinaria. Rev Soc Bol Ped 2008; 47 (2): 81- 5.
36. Luján-Roca, Giovanni R. Pajuelo-Camacho. Método rápido para la detección de bacteriuria en examen microscópico de orina no centrifugada.. Rev Biomed 2005; 16:169-173
37. Stephanie Braun J., Recomendaciones para el diagnóstico microbiológico de la infección urinaria. Rev. Chil. infectol. 2001; 18(1):57-63.
38. Barlett R. A plea for clinical relevance in microbiology. Am j Clin Pathol 1974; 61:867-872.
39. Murray PR, Washimgton JA II. Microscopic and bacteriologic analysis of expectorated sputum. Mayo Clin Proc 1975; 33:161-165.
40. Cercenado Emilia y Cantón Rafael. Procedimientos en microbiología clínica: Bacterias anaerobias. Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. Fecha: Julio 4/2012. Disponible: www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiología/cap16.pdf.
41. García C et al. Rendimiento del estudio microbiológico en el diagnostico de infección osteoarticular. Rev Chil Infec (2000); 17 (2): 101-108.
42. Guerrero JA. Infecciones osteoarticulares y de partes blandas. Procedimientos en microbiología clínica: Bacterias anaerobias. Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. Fecha: Julio 4/2012. Disponible: www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiología/cap16.pdf
43. Alonso C, Bartolomé R, Domínguez J, Matas L, Rabella N. Técnicas rápidas de detección de antígeno. Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. 2005. Fecha: Julio 25/2012. Disponible: www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiología/cap16.pdf.
44. Baines PB, Hart CA. Severe meningococcal disease in childhood. Br J Anaesth.2003; 90: 72-83.
45. Rai GP, Zachariah K, Sharma R, Phadke S, Belapurkar KM. Development of a sandwich dot-enzyme linked immunosorbent assay for Streptococcus pneumoniae antigen detection in cerebrospinal fluid. Comp Immun Microbiol Infect Dis 2004; 27: 217-223.
46. Maxson S, Lewno MJ, Schutze GE. Clinical usefulness of cerebrospinal fluid bacterial antigen studies. J Pediatr 1994; 125:235-238.