Cultivo, aislamiento e identificación de células madre de pulpa dental: una alternativa en medicina regenerativa

Cultivo, aislamiento e identificación de células madre de pulpa dental: una alternativa en medicina regenerativa

Autor principal: Julio César Flores Preciado

Vol. XVI; nº 5; 209

Culture, insolation, and identification of dental pulp stem cells: a regenerative medicine alternative

Fecha de recepción: 03/02/2021

Fecha de aceptación: 04/03/2021

Incluido en Revista Electrónica de PortalesMedicos.com Volumen XVI. Número 5 –  Primera quincena de Marzo de 2021 – Página inicial: Vol. XVI; nº 5; 209 

Autores:

Julio César Flores Preciado, Cirujano Dentista, Doctor en Ciencias área biomateriales y biotecnología. Universidad Autónoma de Baja California, Facultad de Odontología Mexicali, México.

Raúl Rosales Ibáñez, Aaron Ríos Rosas, Especialista en Ortodoncia, Doctor en Ciencia área ingeniería de tejidos y medicina regenerativa, Universidad Nacional Autónoma de México, México.

RESUMEN

En la actualidad la medicina regenerativa e ingeniería de tejidos establecen una sinergia de interés científico global. La aplicación terapéutica de células madre de pulpa dental debido a su capacidad de proliferación e inducción, demuestran su alto potencial regenerativo. Los defectos óseos derivados de lesiones traumáticas o enfermedades degenerativas comprometen las expectativas de recuperación debido a los tratamientos radicales y a los pobres resultados que éstos ofrecen. Por tal motivo, éste estudio tiene como propósito fundamental el cultivo exitoso de células madre y su validación histoquímica, con una visión futura en su caracterización e inducción al linaje osteogénico para su implementación en un constructor tisular, formado por las células madre, un biopolímero y un agente inductor necesarios para la configuración de un sistema tisular. En conclusión, los resultados muestran que a partir de la pulpa dental es posible aislar células madre capaces de proliferar, ser identificadas por inmunohistoquímica con un alto potencial de organización creando un microambiente celular óptimo que asegura la regeneración tisular exitosa, en un menor periodo de tiempo, con mejores resultados y expectativas de recuperación.

PALABRAS CLAVE

andamio, células madre, constructo tisular, inmunohistoquímica, linaje osteogénico, medicina regenerativa.

ABSTRACT

Currently regenerative medicine and tissue engineering establish a synergy of global scientific interest. Therapeutic application of dental pulp stem cells due to their proliferation and induction capabilities demonstrates their high regenerative potential. Bone defects arising from traumatic injuries or degenerative diseases compromise recovery expectations due to radical treatments and the poor results they offer. For this reason, the fundamental purpose of this study is the successful cultivation of stem cells of dental pulp and its immunohistochemical validation, with a future vision in its characterization and cellular induction to the osteogenic lineage, for its implementation in a tissue construct: formed by stem cells, a biopolymer and an inducing agent for cell implantation and proliferation, necessary in the configuration of the tissue system. In conclusion, the results show that from dental pulp it is possible to isolate stem cells capable of proliferating, be identified by immunohistochemistry with a high potential for differentiation and organization in a scaffold can be implanted in an area of bone injury, thus it is possible to produce successful tissue regeneration, in a shorter period, with better results and recovery expectations.

KEYWORDS

scaffold, stem cell, tissular construct, immunohistochemical, osteogenic lineage, regenerative medicine.

Los autores de este manuscrito declaran que:

Todos ellos han participado en su elaboración y no tienen conflicto de intereses.

La investigación se ha realizado siguiendo las Pautas éticas internacionales para la investigación relacionada con la salud con seres humanos elaboradas por el Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ciencias Médicas (CIOMS) en colaboración con la Organización Mundial de la Salud (OMS) https://cioms.ch/publications/product/pautas-eticas-internacionales-para-la-investigacion-relacionada-con-la-salud-con-seres-humanos/

El manuscrito es original y no contiene plagio.

El manuscrito no ha sido publicado en ningún medio y no está en proceso de revisión en otra revista.

Han obtenido los permisos necesarios para las imágenes y gráficos utilizados.

Han preservado las identidades de los pacientes.

INTRODUCCIÓN

Una célula madre es una célula formadora, no especializada, con la capacidad de auto renovarse¹ mediante división celular, seguida de una etapa de diferenciación específica de forma autónoma o inducida, para finalmente originar células de uno o más tejidos específicas, diferenciadas, maduras y funcionales, por lo cual, son consideradas como células genéricas capaces de hacer copias exactas de sí mismas de forma indefinida.

Las investigaciones recientes sobre células madre resaltan el gran potencial que tienen para la regeneración de tejidos in vitro e in situ, abriéndose con ello, un amplio panorama en su aplicación terapéutica en áreas de las ciencias de la salud (medicina regenerativa) y bioingeniería (ingeniería de tejidos y biomateriales).

La medicina regenerativa, disciplina del área médica dirige investigaciones actuales al estudio sobre células madre y su potencial de diferenciación en células de diferentes tejidos².  Estos estudios se basan en la terapia celular, la administración de complejos celulares e inductores³, matrices biológicas o biomateriales y protocolos diseñados mediante la interdisciplina con otras ciencias como la ingeniería de tejidos.

A.    Antecedentes de estudio de las células madre.

Para inicios de 1970, con las nuevas técnicas de trasplantes e investigaciones sobre el uso de materiales y aparatos biocompatibles, se establece un nuevo campo de estudio interdisciplinario llamado ingeniería tisular. A mediados de 1980, las investigaciones centraban su interés de estudio a una familia de células muy prometedoras, las células madre mesenquimales (CMM) adultas con cualidades de interés, de las que destacaban su capacidad de autorenovación y su división pluripotencial⁴.

En 1988 en los Estados Unidos, científicos de la Universidad de Wisconsin, obtienen por primera vez células madre embrionarias humanas de cordón umbilical, cuyo auge radica, debido a que a finales de 1998 se da a conocer que las mismas, habían sido cultivadas con éxito, obteniendo hueso, músculo, piel y otros tejidos.

En el año 2000, inicialmente con el aislamiento de las células madre adultas de pulpa dental (DPSCs) de terceros molares, seguido en el  2003 por las células madre de dientes exfoliados deciduos (SHEDs), posteriormente un amplio semillero de células madre adultas, las células madre de papila apical (SCAPs), las células madre de ligamento periodontal (PDLSCs), las células madre de folículo dental (DFPCs) y finalmente con el descubrimiento de las células madre de rugas palatinas^5,6,7 se abre un abanico  en el cultivo, asilamiento y diferenciación de células madre adultas no embrionarias; desde entonces, las poblaciones celulares de cavidad oral, constituyen una exclusiva familia de células muy prometedoras en la terapia regenerativa

B.       Células madre dentales y su potencial uso terapéutico.

La ingeniería de tejidos  combina el uso de células madre de cavidad oral (DSCs) debido al acceso fácil, no invasivo y la prometedora gama de aplicaciones, con el diseño y síntesis de andamios bioactivos, inductores y señalizadores ofreciendo una poderosa herramienta biológica para la solución de  los problemas clínicos que involucran defectos estructurales y funcionales derivados de enfermedades sistémicas y lesiones degenerativas^8,9 en terapias de reparación, regeneración y sustitución tisular.

De las familias de DSCs, la población de DPSCs resulta muy evidente; la característica más representativa, es su capacidad elevada de regeneración tanto del complejo dentino-pulpar, así como su potencialidad de diferenciación, aplicables en terapias regenerativas en padecimientos como diabetes mellitus, enfermedades neurológicas y lesiones de tejido óseo y cartilaginoso^10,11.

Desde sus orígenes hasta la actualidad, la terapia celular se ha sustentado en la administración de células indiferenciadas con alto grado de especialización; de igual forma, en el reemplazo de las células dañadas por células sanas, para la reparación de los tejidos afectados, mediante mecanismos similares a los que de forma natural se establecen el organismo para la renovación de las poblaciones celulares, radicando en ello, la importancia de su estudio y el propósito de esta investigación.

MATERIALES Y MÉTODOS.

Se realizó un estudio prospectivo basado en la recolección, análisis e interpretación de resultados, ver imagen n^o1: diseño experimental del proceso de obtención y validación de células madre de pulpa dental (al final del artículo). El modelo experimental desarrollado para la obtención de las muestras de DPSCs de dientes permanentes corresponde al siguiente:

A.    Obtención de la muestra.

Para la determinación de la muestra o pieza dentaria se establecieron criterios de inclusión y exclusión, que incluyen tanto características anatómicas, como también las condiciones clínicas que la misma debe presentar¹², ver tabla n^o1: criterios de selección de las piezas dentarias (al final del artículo).

La extracción simple o tratamiento quirúrgico de los terceros molares se llevaron siguiendo los protocolos establecidos, referente a la metodología de trabajo, manejo y normas de bioseguridad¹³. Dentro de los parámetros incluidos para tal protocolo se enlistan los siguientes: historia clínica médico-odontológica, serie radiográfica completa; el material de trabajo que incluye anestesia tópica (benzocaína tópica al 20%), cartucho de anestesia local de infiltración (lidocaína HCl 2%, epinefrina 1:1000,000 o en su caso lidocaína HCl 2% sin vaso constrictor); el instrumental de trabajo que incluye elevadores y fórceps dentales (de acuerdo a la zona a realizar la exodoncia) y las técnicas de anestesia y cirugía de acuerdo con el cuadrante de trabajo¹⁴. Para el mantenimiento de la integridad pulpar y reducir el riego de contaminaciones cruzadas se implementó un soporte higiénico al paciente, basado en la realización de un tratamiento profiláctico que incluye la fase 1 periodontal y enjuague antiséptico bactericida y fungicida con 10 mL de Clorhexidina al 0,12%.

B.    Procesamiento de la muestra.

Realizada la exodoncia, las muestras se resguardaron en un contenedor plástico rotulado, estéril y de cierre hermético, que además de almacenar, permite un adecuado transporte, para la conservación de las muestras; en ambos casos inicialmente se conservaron a una temperatura de 4 ^oC por un periodo de 4 a 6 horas, para posteriormente continuar con la extirpación y segmentación de las muestras pulpares, ver imagen n^o2: solución enriquecida de almacenamiento y transporte (al final del artículo).

La odontosección se realizó a nivel del cuello anatómico del diente, separando así la corona anatómica (para la obtención de la pulpa cameral) de la raíz (para la obtención de la pulpa radicular) y mediante la técnica de fragmentación por explantes se obtuvieron muestras de 1mm² de tejido pulpar por muestra íntegra siguiendo posteriormente con el cultivo de las muestras obtenidas, ver imagen n^o3: obtención de la muestra de tejido pulpar (al final del artículo).

C.    Desarrollo del cultivo celular.

Un total de 12 a 16 explantes pulpares de 1 mm² se colocaron en cada caja de cultivo siguiendo las especificaciones de la técnica de siembra por cuadrícula, creando un espacio adecuado entre cada uno de los explantes y dejando reposar por 5 minutos, asegurando la adherencia a la base de la caja, posteriormente se adicionó el medio de cultivo suplementado DMEM, ver imagen n^o4: siembra por explante en cuadriculado (al final del artículo). Los explantes pulpares sembrados se incubaron en una atmósfera del CO₂ al 5% con una temperatura de 37^oC, posterior a la siembra, durante el tiempo de incubación, el medio de cultivo suplementado fue reemplazo periódicamente, retirándose en su totalidad por aspiración al vacío, seguido del reposo de 5 minutos para adherencia superficial del explante y finalmente la suplementación con 5 mL del medio de cultivo modificado y enriquecido; este sistema de mantenimiento se programó por semana de cultivo.

D.    Validación del crecimiento celular.

Se llevaron a cabo dos técnicas de validación, morfológica para corroborar crecimiento celular e inmunohistoquímica para la identificación estromal y estructural de las células madre pulpares. Mediante el uso de microscopía óptica invertida, permitió establecer la identificación celular por su estructura o forma, así como también por los conglomerados celulares desarrollados y establecidos por las clonas de células madre.

La determinación del reconocimiento estromal y estructural se realizó mediante la validación inmunohistoquímica por inmunomarcaje, determinando la expresión de anticuerpos monoclonales y policlonales que reaccionan con antígenos de superficie y fluoróforos, detectable mediante el empleo de técnicas microscópicas de fluorescencia^{15, 16}.

Se implementaron dos mecanismos de inmunomarcaje, el primero, de acuerdo al tipo de reacción antígeno-anticuerpo, basado en tres vías, la vía directa donde el marcador o anticuerpo primario se acopla de forma directa al antígeno, la vía indirecta donde el marcador o anticuerpo primario para acoplarse al antígeno requiere de la presencia de un anticuerpo secundario y la vía por amplificación donde el marcador o anticuerpo primario se une a un agente amplificador (medio de detección) el cual le permite reaccionar con el antígeno (agente colorante o fluoróforo), por otra parte, el segundo mecanismo corresponde al número de anticuerpos empleados^{17, 18} del cual destaca el inmunomarcaje triple que se basa en el uso de anticuerpos de reconocimiento celular, reconocimiento estructural  y moléculas fluorescentes de amplificación, siendo éste, el utilizado en la validación inmunohistoquímica para las clonas de DPSCs obtenidas.

III. RESULTADOS.

Reconocimiento estructural.

Se realizó la validación morfológica a partir del tercer día de siembra, siendo posible establecer la identificación positiva, donde se muestra la característica estructural propia de las DPSCs en un cultivo in vitro observándose una morfología fibroblástica y la formación típica de colonias circulares¹⁹, ver imagen n^o5: valoración morfológica del crecimiento celular DPSCs, 3, 5 y 7 días de siembra (al final del artículo).

B.    Viabilidad celular.

Para la valoración de la viabilidad celular de los cultivos de células madre de pulpa dental se empleó un kit vida y muerte celular estandarizado (LIVE/DEAD^®. Cell Viability Assays. Life Technologies™) el cual permite la determinación fácil y sensible de la viabilidad celular, la  citotoxicidad de compuestos, el medio en que se desarrolló el cultivo y las condiciones en que se realizó el mismo^{20, 21}. El resultado se establece debido al marcaje celular por la fijación del fluoróforo o colorante a receptores membranales o citoplasmáticos, expresándose las membranas celulares integras de color verde estableciendo con ello complejos celulares activos mitóticamente y marcando de color rojo por la fijación del fluoróforo a receptores citoplasmáticos intracelulares para las células en etapa de apoptosis o restos celulares, determinándose con ello la viabilidad de los cultivos celulares por mantenimiento de la integridad celular y confluencia, ver imagen n^o6: viabilidad celular: test de vida y muerte (al final del artículo).

C.    Reconocimiento estromal.

Para la identificación positiva a células madre se estableció el ensayo inmunohistoquímico de reconocimiento y amplificación para células madre mesenquimales por detección del marcador específico STRO-1²² y los marcadores de membrana ALEXA F594 y Cy5, estableciéndose el que las células presentes en los cultivos celulares corresponden a clonas de células madre derivadas de pulpa dental, ver imagen n^o7: reconocimiento estromal positivo (al final del artículo).

D.    Reconocimiento estructural.

Mediante el uso de marcadores estructurales (vinculina, faloidina y sytox) se revelan las diferentes estructuras y organelos presentes en las muestras celulares derivadas de los cultivos pulpares, tales como el citoesqueleto que permite la interacción y comunicación intercelular, así como las membranas nucleares y su actividad mitótica. Los cultivos celulares obtenidos muestran estructuras del citoesqueleto correspondientes a filopodios o microespículas y lamelipodios, que son estructuras transmembranales múltiples asociadas al citoesqueleto de actina cuyo objetivo es establecer vías de adhesión y organización celular (célula-célula) propias de la generación de microambientes, así como también la actividad nuclear por el reconocimiento de la integridad de las membranas nucleares que generalmente corresponden a complejos activos mitóticamente, ver imagen n^o8: identificación de componentes estructurales básicos (al final del artículo).

CONCLUSIONES.

La tendencia actual en cuanto a la terapéutica está dirigida a la solución integral de afecciones o padecimientos          que afectan y deterioran la calidad de vida de las personas ya que los tratamientos ante afecciones agresivas son muy radicales y los resultados además de ser reservados, son dolorosos y con bajas expectativas de recuperación integral.

Las células madre cumplen un papel vital en esta sinergia entre campos de estudio, pero su medio de obtención en cuanto a la naturaleza de la muestra y el manejo de estas para su producción y proliferación, han detenido el avance en cuanto al estudio de sus aplicaciones y beneficios. Es por eso por lo que las células madre mesenquimales de origen dental están revolucionando el estudio de la terapéutica celular y su modelo aplicativo en la terapia regenerativa.

Los resultados obtenidos, indican que las muestras obtenidas a partir de la fragmentación y explantes de pulpas dentales humanas, son capaces de originar poblaciones celulares que expresan su capacidad de división y proliferación originando con ello clonas de células mesenquimales adultas de pulpa dental (DPSCs) evidenciadas por las características estructurales propias de las mismas, así como también por mostrar marcadores típicos expresados en las validaciones inmunohistoquímicas.

Sin embargo, es necesario implementar validaciones y ensayos de comportamiento celular, basados en la expresión de la actividad del citoesqueleto de las células asiladas el cual es un factor determinante de las vías de comunicación celular para determinar la interacción de las células cultivadas y aisladas en un ambiente biológico para medir así, su grado de proliferación, inducción y diferenciación en un uso potencialmente clínico en terapias de reparación y regeneración tisular.

Ver anexo

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