Desarrollo de un constructo tisular por técnica de descelularización traqueal

Desarrollo de un constructo tisular por técnica de descelularización traqueal

Autor principal: Julio César Flores Preciado

Vol. XVII; nº 8; 325

Development of a tissue construct by tracheal decellularization technique

Fecha de recepción: 02/03/2022

Fecha de aceptación: 18/04/2022

Incluido en Revista Electrónica de PortalesMedicos.com Volumen XVII. Número 8 – Segunda quincena de Abril de 2022 – Página inicial: Vol. XVII; nº 8; 325 

Autores:

Julio César Flores Preciado, Cirujano Dentista, Doctor en Ciencias área biomateriales y biotecnología. Universidad Autónoma de Baja California, México.

RESUMEN

La ingeniería de tejidos es un área científica interdisciplinaria que tiene como fundamento principal, la creación e implantación de sustitutos biológicos con el objetivo de reparar, reemplazar, mantener o mejorar la función específica de un tejido u órgano. Mediante la combinación de aspectos tecnológicos novedosos e innovadores, la ingeniería de tejidos y de órganos tiene una nueva herramienta de reemplazo celular, por medio del uso de células troncales o madre las cuales pueden ser cultivas, aisladas y diferenciadas en el laboratorio para su posterior incorporación a un órgano o tejido dañado induciendo directamente su reparación estructural y funcional. El cuerpo humano, es un sistema biológico activo interactivo, en el cual, se desarrollan simultánea y sistemáticamente funciones vitales de supervivencia, mediante la interacción de complejos celulares, tejidos y órganos, los cuales conjuntan sus funciones individuales y grupales específicas para el mantenimiento de su integridad. La pérdida funcional o estructural de forma parcial o total de un tejido u órgano, es una condición que afecta frecuentemente y representa un grave problema de salud pública por si incidencia y costos. Debido a esta creciente necesidad de órganos, se han establecido investigaciones recientes sobre el uso de células autólogas¹ para la reconstrucción de tejidos y órganos, asegurando la biocompatibilidad² y evitando así las terapias inmunosupresoras las cuales no aseguran la aceptación del tejido u órgano trasplantado, con lo cual se abre un nuevo campo en la medicina regenerativa, la regeneración tisular y regeneración orgánica directa.

PALABRAS CLAVE

constructo, descelularización, citoesqueleto, ingeniería de tejidos, inmunofluorescencia, recelularización.

ABSTRACT

Tissue engineering is an interdisciplinary scientific area whose main foundation is the creation and implantation of biological substitutes with the aim of repairing, replacing, maintaining, or improving the specific function of a tissue or organ. Through the combination of new and innovative technological aspects, tissue and organ engineering has a new cell replacement tool, using stem or stem cells which can be cultivated, isolated, and differentiated in the laboratory for their subsequent incorporation into a damaged organ or tissue directly inducing its structural and functional repair. The human body is an interactive active biological system, in which vital functions of survival are developed simultaneously and systematically, through the interaction of cellular complexes, tissues and organs, which combine their specific individual and group functions for the maintenance of their health. integrity. The partial or total functional or structural loss of a tissue or organ is a condition that frequently affects and represents a serious public health problem due to its incidence and costs. Due to this growing need for organs, recent research has been established on the use of autologous cells for the reconstruction of tissues and organs, ensuring biocompatibility and thus avoiding immunosuppressive therapies which do not ensure acceptance of the transplanted tissue or organ, thus which opens a new field in regenerative medicine, tissue regeneration and direct organic regeneration.

KEYWORDS

construct, decellularization, cytoskeleton, tissue engineering, immunofluorescence, recellularization.

Los autores de este manuscrito declaran que:

Todos ellos han participado en su elaboración y no tienen conflicto de intereses.

La investigación se ha realizado siguiendo las Pautas éticas internacionales para la investigación relacionada con la salud con seres humanos elaboradas por el Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ciencias Médicas (CIOMS) en colaboración con la Organización Mundial de la Salud (OMS) https://cioms.ch/publications/product/pautas-eticas-internacionales-para-la-investigacion-relacionada-con-la-salud-con-seres-humanos/

El manuscrito es original y no contiene plagio.

El manuscrito no ha sido publicado en ningún medio y no está en proceso de revisión en otra revista.

Han obtenido los permisos necesarios para las imágenes y gráficos utilizados.

Han preservado las identidades de los pacientes.

INTRODUCCIÓN

La matriz extracelular (MEC) representa una red tridimensional de soporte que engloba todos los órganos, tejidos y células del organismo. Constituye un filtro biofísico de protección, nutrición e inervación celular y el terreno para la respuesta inmune, angiogénesis, fibrosis y regeneración tisular, configurada por complejos fundamentales de proteínas y azucares que permiten establecer un microambiente celular óptimo, indispensable para la organización y comunicación inter e intracelular.

Tejido cartilaginoso.

Se caracteriza por tener una consistencia rígida, pero a la vez flexible; ofrece poca resistencia a la presión, recuperando su forma cuando aquella cesa, a esta propiedad se le conoce como resiliencia. Como todo tejido conjuntivo, está formado por células y por matriz cartilaginosa integrada a su vez por componentes amorfos y fibrilares.

Matriz cartilaginosa.

Está constituida por sustancia amorfa y fibras conjuntivas. La matriz amorfa está integrada por cadenas de moléculas de ácido hialurónico que se unen mediante enlaces no covalentes con 100 o 200 moléculas de glucosaminoglicanos³ unidos a través de proteínas de enlace formando proteoglicanos⁴. Los glucosaminoglicanos formadores de proteoglicanos son el ácido condroitín-4-sulfato, condroitín-6- sulfato y el heparán sulfato, los cuales tienen la capacidad de albergar una cantidad considerable de moléculas de agua. La viscosidad y densidad de la matriz y el contenido de agua permiten la difusión de sustancias para que se realice el metabolismo del tejido. La matriz fibrilar esta configura por fibras conjuntivas del tipo: colágenas, reticulares y elásticas.

Complejos celulares cartilaginosos.

El tejido cartilaginoso está conformado básicamente por tres complejos celulares, las células condrogénicas, los condroblastos y los condrocitos. Las células condrogénicas derivan de las células mesenquimatosas, tienen forma de huso (fusiformes), ligeramente alargadas, pudiéndose diferenciar a células osteo-condrógenas dependiendo del microambiente que las rodea. Los condroblastos tienen forma fusiforme cuyo contorno se modifica paulatinamente a ovaladas, poseen un citoplasma basófilo, además de conservar la capacidad de reproducirse, originando a otros condroblastos o diferenciarse en condrocitos jóvenes. Finalmente, los condrocitos, son las células más abundantes del cartílago con una función esencial en la síntesis y secreción de matriz cartilaginosa. Los condrocitos ocupan cavidades de la matriz denominadas lagunas cartilaginosas donde pueden albergarse dos o más células, especialmente en cartílagos de individuos adultos^5,6,7.

Proceso de obtención y transformación de bioestructuras.

Debido al sin número de afecciones y padecimientos, en la actualidad con los conocimientos de ingeniería de tejidos, medicina regenerativa y medicina traslacional, los estudios se han centrado en la generación de nuevos materiales y alternativas para la sustitución de órganos y tejidos dañados. Existen técnicas muy prometedoras para la reparación o regeneración de tejidos y órganos, mediante el empleo de biomateriales como estructuras de armazón, adaptación e inclusión por medio del uso directo del órgano afectado como andamio biológico natural o nativo, aunado a la potencial y muy prometedora terapia celular mediante la aplicación directa de células madre o troncales, las cuales, con su elevada capacidad de diferenciación, promuevan la regeneración del tejido y órgano, siguiendo con estos conceptos la triada de la ingeniería de tejidos. Así cómo es posible la regeneración de tejidos de forma artificial y de una práctica más frecuente, también existe la posibilidad de la formación u obtención artificial de órganos completos o porciones de estos a partir de la ingeniería de tejidos, a los cuales se les conoce como “bioórganos⁸”.

El proceso de bioformación u obtención de un órgano artificial, se desarrolla mediante una técnica doble, basada en un estudio in vitro e in vivo. Un órgano artificial es aquel que se obtiene mediante recursos biológicos externos al organismo a implantar o bien, propios del individuo receptor, con ello se evita el rechazo debido a que los complejos empleados son autólogos o propios y son construidos con el uso de células cultivadas en un armazón o andamio nativo o natural.

El mecanismo de obtención de un armazón biológico para su posterior repoblación celular o reconstrucción tisular se conoce como proceso de descelularización y recelularización^9,10, a diferencia de un armazón sintético el cual emplea un andamio a base de un biomaterial que a su vez es repoblado con células cultivadas o derivadas de igual forma del individuo receptor. El mecanismo para la obtención de un órgano artificial in vitro se establece en dos etapas¹¹:

• Descelularización: esta etapa consiste en la eliminación total de contenido celular y tisular del órgano, conservando la matriz extracelular compuesta por tejido conjuntivo de soporte no especializado (generalmente colágeno o elastina) así como también los componentes vasculares y nerviosos.
• Recelularización: la cual consiste en la adición o resembrado de células, que mediante un crecimiento in vitro, son inducida para su proliferación y diferenciación, en el órgano descelularizado in vitro e in vivo.

METODOLOGÍA

 

Las etapas de trabajo experimental van desde la obtención y procesamiento de la muestra, el desarrollo de la técnica de descelularización mediante el uso de detergentes y enzimas para la obtención de la matriz extracelular orgánica evaluada y validada mediante técnicas bioquímicas, histológicas, inmunológicas y de microscopia.

Obtención y procesamiento de la muestra.

De manera inicial se llevó a cabo la identificación de las muestras traqueales a tratar basadas en su configuración cartilaginosa y abundancia de matriz extracelular con el objeto de uso en la obtención de la bioestructura.¹ Para la obtención se estandarizó un protocolo de recepción y transporte basado en la preservación, almacenaje y transporte con el propósito de disminuir y frenar los procesos de degradación celular siguiendo los principios de hiperosmolaridad³ y el de riqueza de potasio.

Posterior a la obtención de las muestras, se procedió a la identificación de las dos regiones que la conforman, la región cervical que se extiende de la región inferior del cartílago cricoides al borde superior del manubrio esternal y, la región torácica formada por una serie de 12 a 16 anillos cartilaginosos, de esta última región se obtuvieron las muestras que finalmente fueron sometidas al proceso de descelularizado, ver imagen n^o1: obtención y procesamiento de las muestras traqueales (al final del artículo).

Posterior a la resección⁸ traqueal, las muestras fueron lavadas repetidamente con agua desionizada para la eliminación de restos sanguíneos y de fluidos orgánicos, como medida de preservación previa al proceso de descelularización, las muestras fueron almacenadas en solución de medio de cultivo celular en base de: Medio DMEM¹² adicionado con solución amortiguadora de antibiótico y antimicótico de Penicilina G 500U/mL, estreptomicina 500 µg/mL y Anfotericina B 1.25 µg/mL.

Técnica de descelularización traqueal.

Como protocolo inicial, se estableció un proceso de descongelación de las muestras traqueales en agua desionizada a temperatura ambiente. Posterior a la descongelación, se continuó con el proceso de descelularización de las muestras bajo el siguiente protocolo:

• Solubilización de las membranas: las muestras fueron colocadas en una solución de inmersión a base de Tritón X-100¹³ al 3% y SDS¹⁴, ver tabla n^o1: características del proceso de lavado secuencial (al final del artículo) en una placa agitadora a 150 rpm a 4 ^oC de temperatura. La serie de lavados secuenciales permiten al detergente iónico surfactante o agente tensoactivo, solubilizar las membranas celulares mediante la degradación de las proteínas incrustadas o periféricas. Este procedimiento se realizó por 48 horas de agitación mecánica, con recambio de la solución de inmersión a las 24 horas de agitación.
• Fase de extracción secuencial: permitió la eliminación de los componentes celulares, la descelularización y desinfección del tejido aislado. Para ello se estableció un protocolo de descelularización de siete ciclos (2.5 días de extracción secuencial) ver tabla n^o2: protocolo de descelularización (al final del artículo). El proceso de descelularizado se llevó a cabo con ambos detergentes iónicos (Tritón X-100 y SDS) ver imagen n^o2: fase de extracción secuencial del proceso de descelularizado (al final del artículo) y dos etapas digestivas (DNAsa/RNAsa) como un protocolo comparativo entre técnicas, ver tabla n^o3: etapas digestivas y lavados secuenciales (al final del artículo).

Preparación final de la matriz extracelular cartilaginosa obtenida.

Las porciones traqueales descelularizadas fueron segmentadas en unidades <5cm de longitud, ver imagen n^o3: procesamiento de la muestra descelularizada (al final del artículo) y lavadas doblemente en solución de PBS¹⁵ estandarizado, para posteriormente ser desinfectado durante 1 hora en solución de etanol al 4% y el posterior almacenamiento en congelado críptico a -80 ^oC, con el objetivo de regular la constitución tisular y continuar con la fase de valoración, bioquímica, histológica, inmunológica y de microscopia.

Técnicas y ensayos de validación de resultados.

Para la validación del proceso de descelularización, se implementaron ensayos bioquímicos, histológicos y de microscopía.

• Ensayos bioquímicos: extracción, purificación y cuantificación de ADN. Para el establecimiento de la técnica se establecieron grupos control y muestra correspondiente a porciones traqueales descelularizadas, ver tabla n^o4: grupos de trabajo para validación del protocolo de descelularizado (al final del artículo). El protocolo de validación bioquímica se conformó por tres etapas, una inicial de digestión enzimática, seguido de la etapa de lisis y precipitación de proteínas y posteriormente la etapa de precipitación y rehidratación del ADN, ver tabla n^o5: etapas del ensayo bioquímico de validación (al final del artículo). Finalmente, para la obtención y registro de resultados, la técnica de elección corresponde a espectrofotometría UV/Visible, datos que son expresados en la sección de resultados.

• Ensayos histológicos: técnica de hematoxilina y eosina. Para la técnica de tinción se obtuvieron muestras de 1.5cm² por microtomía, seguido del protocolo de tinción: fijación, inclusión, coloración o tinción y montaje, ver tabla n^o7: proceso de tinción histológica (al final del artículo).
• Microscopía: establece la identificación de los componentes proteicos asociados a la matriz extracelular, así como también los complejos de azucares asociados a proteínas (oligosacáridos y polisacáridos) presentes en la matriz extracelular y con una función adicional de comunicación y adhesión celular, datos que son expresados en la sección de resultados.

• RESULTADOS

Extracción, purificación y cuantificación de ADN.

La espectrofotometría UV/Visible permite confirmar que se cuenta con cantidad suficiente de ácidos nucleicos (DNA/RNA) de calidad antes de llevar a cabo ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real (QRTPCR), análisis de SNPS (polimorfismos de nucleótido único) o la secuenciación automática de muestras de ADN de plásmidos, técnicas histológicas e inmunológicas, así como también valoración por microscopia. El análisis de resultados de los controles y muestras llevadas a lectura muestran las lecturas de DO a 260 y 280 nm, la razón de pureza (DO 260/280) y las concentraciones de ADN obtenidas, ver tabla n^o6: DO obtenida para muestra y tejido descelularizado por espectrofotometría (al final del artículo).  Las muestras descelularizadas procesadas y graficadas indican una baja concentración (contenido) de ácidos nucleicos a comparación de las muestras control correspondientes a un tejido con baja concentración de poblaciones celulares ver figura n^o1: DO, lecturas y validaciones obtenidas por espectrofotometría (al final del artículo).

Análisis histológico y de microscopía.

Mediante el análisis histológico por la técnica de hematoxilina-eosina es posible detectar componentes celulares y estructuras ácidas (hematoxilina) como el núcleo, el contenido nuclear (ADN) y componentes presentes en la matriz extracelular (glucosaminoglicanos) tiñéndolos de un color azul y purpura. Mientras que las estructuras básicas (eosina) como las regiones proteicas en el citoplasma y redes de colágena en la matriz extracelular que son teñidas en un color rosado. El análisis microscópico evidencia las diferencias entre los protocolos de descelularización traqueal no estandarizado y estandarizado, ver imagen n^o4: análisis de microscopia por hematoxilina-eosina (al final del artículo) donde la presencia abundante de fibras proteicas en la matriz extracelular hace referencia a niveles de descelularización por arriba del 80-85%.

Respecto a la metodología de descelularización establecida:

• Con el ajuste de la técnica de descelularización, en cuanto a la modificación de los tiempos de lavado y el uso de detergentes, se estableció una diferencia significativa en el promedio de descelularizado de los tejidos alcanzando niveles por arriba del 85-90%.
• Es necesario ajustar las concentraciones de los detergentes y algunos intervalos adicionales, con lo cual es posible incrementar el grado de descelularización a un 90 a 95%, los cuales, según la bibliografía, es un nivel óptimo para la consideración de grado de descelularización aceptable biológicamente.
• Es necesario establecer estrategias que corresponden a terapia celular, utilización de moléculas inductoras de regeneración tisular y el uso de bioconstrucciones que fueron obtenidos mediante la técnica de ingeniería tisular.

Respecto a la continuidad:

Una vez obtenidos los constructos tisulares es posible identificar el seguimiento y los estudios futuros para el proceso de recelularizado:

• Implementar un sistema tisular (constructo tridimensional), formado por las células aisladas, la matriz extracelular descelularizada y agentes proteicos inductores.
• Implementar un sistema tisular in vitro e in vivo en una zona de defecto, para guiar y producir un remodelado y regeneración.
• Establecimiento del protocolo de citotoxicidad y biocompatibilidad de la matriz extracelular.
• Evaluación morfológica por microscopia electrónica, para la confirmación del grado de descelularización del tejido y la evaluación morfológica y funcional de la matriz extracelular, así como el desarrollo de la fase de recelularización con lo cual se evaluará la viabilidad del constructo.

Ver anexo

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