Pruebas genéticas para la visualización de posibles mutaciones en los genes BRCA1 Y BRCA2, claros referentes en la patología del cáncer de mama

Pruebas genéticas para la visualización de posibles mutaciones en los genes BRCA1 Y BRCA2, claros referentes en la patología del cáncer de mama

Autora principal: Eva María Valella López

Vol. XV; nº 10; 421

Genetic tests for the visualization of possible mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes, clear references in the pathology of breast cancer

Fecha de recepción: 06/04/2020

Fecha de aceptación: 18/05/2020

Incluido en Revista Electrónica de PortalesMedicos.com Volumen XV. Número 10 –  Segunda quincena de Mayo de 2020 – Página inicial: Vol. XV; nº 10; 421

Autora: Eva María Valella López, Técnico superior de Laboratorio Clínico y Biomédico en Hospital Universitario Central de Asturias.

Resumen:

El cáncer de mama se encuentra entre las primeras patologías con mayor incidencia entre las mujeres de todo el mundo, no obstante, esta es una enfermedad también  padecida por personas del sexo masculino, aunque en un porcentaje significativamente inferior.

En España el cáncer de mama es uno de los principales tipos de neoplasia maligna más  extendida. Entre las principales causas por las que se genera, después de los diferentes factores de riesgo como pueden ser la obesidad, tabaquismo, alcoholismo o sedentarismo, se encuentran las predisposiciones genéticas debido a mutaciones establecidas en diferentes genes entre los que destacan el BRCA1 Y BRCA2, que son los dos tipos de genes que tienen una mayor correlación con el cáncer de mama hereditario. Se considera que entre un 5 y un 10% de los casos diagnosticados son debidos a la mutación de los genes anteriormente mencionados, no obstante, también intervienen más genes como pueden ser p53, PTEN, ATM, entre otros.  Dichas mutaciones pueden detectarse mediante ciertas pruebas realizadas en el laboratorio a partir de muestras de sangre o del mismo tumor, como son la técnica de extracción de ADN y posteriormente el uso de los paneles de genes que incluyen la fragmentación, e hibridación realizada mediante PCR y secuenciación, que puede ser realizada por diferentes técnicas. Gracias a estos estudios genéticos puede detectarse si el cáncer es debido a factores de riesgo externos o por el contrario se reproduce por la disposición genética que el paciente tiene ante esta patología.

Gracias a la realización de dichas pruebas de manera precoz y en caso de existir un diagnóstico positivo de la enfermedad, con las diferentes terapias farmacológicas y quirúrgicas como es la mastectomía simple o radical en el caso del cáncer de mama, existe actualmente un porcentaje de curación de dicho tipo de neoplasia de entre un 70% y un 90%.

PALABRAS CLAVE: cáncer, ADN, genes, hibridación, secuenciación

Abstract:

Breast cancer is among the first pathologies with the highest incidence among women around the world, however, this is a disease also suffered by men but in a significantly lower percentage. In Spain, breast cancer is the fourth most widespread type of malignant neoplasm, among the main causes for which it is generated, after different risk factors such as obesity, smoking, alcoholism or sedentary lifestyle, there are established mutations in different genes among which BRCA1 and BRCA2 stand out, which are the two types of genes that have a greater correlation with hereditary breast cancer. It is considered that between 5% and 10% of the cases diagnosed are due to the mutation of the previously mentioned genes, however, more genes are also involved such as p53, PTEN, ATM, among others. Such mutations can be detected by certain tests performed in the laboratory from blood or tumor samples, such as the DNA extraction technique and subsequently the use of gene panels that include fragmentation, hybridization and sequencing with different techniques. . Thanks to these genetic studies it can be detected if the cancer is due to external risk factors or, on the contrary, it is reproduced by the genetic disposition that the patient has before this pathology. Thanks to the performance of such tests early and in case there is a positive diagnosis of the disease, with the different therapies with medications and surgeries such as simple or radical mastectomy in the case of breast cancer, there is currently a percentage of cure of said type of neoplasm between 70% and 90%.

KEYWORDS: cancer, DNA, genes, hybridization, sequencing

Introducción:

Etiología del cáncer de mama:

La patología designada como “Cáncer”, está relacionada con una denominación genérica que engloba una gran cantidad de enfermedades que pueden llegar a alcanzar cualquier parte del organismo. Puede designarse de diferentes maneras tales como tumor maligno o neoplasia maligna ⁽¹⁾.

Lo que conocemos como cáncer de mama es una  neoplasia maligna producida en el tejido glandular mamario. Las células constituyen los órganos y tejidos de nuestro organismo realizando una división celular de manera regulada para  sustituir o reponer las células estropeadas, envejecidas o muertas, haciendo que los órganos funcionen de manera correcta. El que la célula sepa cuando tiene que dividirse o cuando tiene que estar estable está regulado por ciertos mecanismos,  la alteración de estos mecanismos origina que las células y sus sucesoras comiencen a dividirse de manera incontrolada pudiendo dar lugar a una masa tumoral, y si además llegan a adquirir la capacidad de invasión, pueden conseguir la conquista de tejidos u órganos tanto adyacentes como de otras partes del cuerpo. Este proceso de invasión celular se conoce con el nombre de metástasis y es la principal causa de mortalidad en esta patología. El tumor formado por dichas células pasaría a ser un tumor maligno, lo que conocemos con el nombre de cáncer ^(1,2).

Orígenes del cáncer de mama:

Ya en la antigüedad se conocía este tipo de cáncer, solo que no se denominaba con el nombre actual. Esta terminología desciende del latín “cancrum” ya que se asocia a la figura del cangrejo. Las primeras referencias que se tienen de esta patología, datan del antiguo Egipto alrededor del año 1600 a. c. Se ha encontrado un documento médico que data de la Dinastía XVIII de este país, en el que se detallaban ciertos casos de tumores que fueron tratados con la llamada “horquilla de fuego”  mediante cauterización, aunque previamente fue descrita como una patología sin tratamiento posible. ^(2,3)

 La primera persona en emplear la terminología “Cáncer” para esta patología, fue el médico de origen turco Galeno, en el siglo II. Este médico describió esta patología como “una tumefacción con venas distendidas similares a las patas de un cangrejo”. ⁽⁴⁾

En el siglo VII, el médico griego Pablo de Egina intentó perfeccionar la técnica de la erradicación de la neoplasia maligna mamaria por el método del raspado de los ganglios de la axila. ^(2,4)

Durante el siglo XVII, el avance del conocimiento del sistema circulatorio del ser humano produjo importantes descubrimientos positivos en los resultados de pruebas realizadas para el diagnóstico de esta patología ⁽²⁾. En el transcurso de este tiempo pudo establecerse una importante relación entre la neoplasia mamaria y los nódulos linfáticos de la axila. Fue, el cirujano Jean Louis Petit, inventor del torniquete  y más adelante uno de los primeros cirujanos de Edimburgo, Benjamín Bell los que realizaron por primera vez una operación quirúrgica en la que se removían los ganglios linfáticos, el tejido de la mama y la musculatura del pecho. Este tipo de cirugía se denominaría con posterioridad como mastectomía radical de Halsted ya que fue creada por el cirujano William Stewart Halsted y fue realizada hasta finales de la década de los años 70 del pasado siglo XX. En este tipo de cirugía, además de la extirpación de toda la mama, se destruía el músculo pectoral mayor que cubre la pared torácica. También se realizaba la extirpación del pectoral menor, para facilitar el acceso a la axila, con objeto de extraer los ganglios linfáticos y la grasa que los rodea. ^(3,4) La palabra mastectomía proviene del griego “mastos” cuyo significado es mama y “ektomée” que significa es extirpación ⁽²⁾. Con anterioridad a esta técnica, el médico griego Leónidas de Alejandría, realizaba otra en la que se efectuaba la extirpación total de la mama, pero sin tocar los ganglios linfáticos ni la musculatura pectoral. Esta técnica es la que con el tiempo pasaría a llamarse mastectomía simple ^(3,4).

Incidencia del cáncer de mama en España:

El cáncer de mama es la principal causa de mortalidad entre personas de sexo femenino con edades comprendidas entre los 35 y 55 años y que viven dentro del ámbito de los  países desarrollados. ⁽⁵⁾

Esta patología es el segundo tipo de cáncer con mayor número de personas afectadas en España y el segundo más abundante en todo el mundo con una incidencia del 11.6%, solo precedido por el cáncer de hígado, a su vez, posee una incidencia de mortalidad del 6,6%.⁽⁶⁾ 

Este tipo de neoplasia es poco frecuente en mujeres con una edad inferior a los 25 años, aumentando su frecuencia de manera directamente proporcional al aumento de la edad de la persona, llegando al punto más alto de la incidencia en edades ya más avanzadas.⁽³⁾

Los cánceres o carcinomas de mama suponen más del 90 % de los tumores malignos de esta zona fisiológica. ^(2,3)

En la actualidad, el cáncer de mama es la neoplasia de mayor frecuencia entre las mujeres en España. Se prevé que a finales del año 2019 los casos nuevos detectados asciendan a 32536. (Anexo 1), mientras que durante el año 2018 se han descrito 32825 nuevos casos de esta misma patología, produciéndose el fallecimiento de unos 6000 de ellos, con edades comprendidas entre los 35 y los 50 años de edad. ^(6,8)  Esta patología también es padecida por los hombres aunque en un menor porcentaje ya que solamente afecta al 1% de esta población ⁽⁷⁾. El nivel de mortalidad de dicha enfermedad poco a poco va disminuyendo gracias a los grandes avances conseguidos en el ámbito de la investigación. Estos avances han conseguido que con los tratamientos planteados en un periodo cercano a los cinco años después del padecimiento de la enfermedad, el porcentaje de casos curados sufriera un incremento  desde el 70% hace algunos años hasta el  90% en la actualidad.^(6,7)

De manera paralela, existe un porcentaje del 30% de diagnósticos de cáncer de mama, localizado de manera precoz, en los que se puede producir una recaída. ^(6,8)

Factores de riesgos más destacados en el cáncer de mama:

La patología de la neoplasia mamaria es poligénica, eso quiere decir que está ocasionada  por la combinación de un gran número de  factores ambientales y mutacionales de  distintos genes, principalmente de diversos cromosomas. Entre los principales factores de riesgo que pueden llegar a ocasionar esta patología se encuentran:

• La edad, ya que la media establecida se encuentra entre los 45 a 55 años, a partir de esta edad la incidencia se vuelve estable.
• El nivel de vida, las personas con alto nivel socioeconómico y las que viven en zonas urbanizadas tienen una mayor probabilidad de padecer esta enfermedad.
• Patrón de natalidad, esto se produce porque cada vez las mujeres tienen menos embarazos y a una edad más tardía.
• Estilo de vida, el sobrepeso por mala alimentación, así como una vida sedentaria pueden llegar a desembocar en un diagnóstico de cáncer de mama.^(4,9)
• Factores hereditarios: un factor muy importante a la hora de padecer esta enfermedad es ser descendente de alguna persona que haya desarrollado esta patología, sobre todo si este es un pariente de primer grado. Una tercera parte de lo/as pacientes con familiares que padecen o padecieron cáncer de mama y/o ovario son portadoras de una mutación heredable en los genes BRCA1 o BRCA2. ⁽⁹⁾

Genes BRCA1 y BRCA2:

Entre el  5 y el 10% de todas las neoplasias malignas de mama muestran un patrón de herencia autosómica dominante, que se determina mediante la transferencia de la propensión genética. ⁽¹⁰⁾

La principal causa de manifestación del cáncer de mama es la presencia de variaciones genéticas. Una de estas variaciones, que es la más común, es la mutación de uno o más genes supresores de tumores, dentro de estos genes, los  más importantes son el BRCA1 y el BRCA2. ⁽¹⁰⁾

El gen BRCA1fue nombrado por primera vez en 1991 por Mary-Claire King. ^(11,24) Localizado en el cromosoma 17 está constituido por 5.592 nucleótidos, repartidos en 24 exones, estos codifican una proteína de 1.863 aminoácidos. ^(8,9) Esta proteína es una nucleoproteína que da lugar a un complejo junto con otras proteínas implicadas en la conservación de la pureza del genoma, principalmente reparando errores en la doble cadena de ADN. ^(7,11)

La mutación que se produce en este gen, parece ser el principal desencadenante de este tipo de neoplasia en el 45% de las familias con varios casos de cáncer de mama y más del 90% de las familias con cáncer de mama y ovario. ^(12,24)

El gen BRCA2 se localiza en el cromosoma 13. Se trata de un gen compuesto por 27 exones que codifican una fosfoproteína nuclear de 3.418 aminoácidos que, de manera similar al BRCA1, interacciona con varias proteínas incluyendo la RAD51 implicada en la reparación de la doble cadena de ADN. ^(12,24)

En el caso de estos dos genes, el hecho de que la función que desempeña la proteína codificada se extravíe, da lugar a un incremento de los errores del genoma, con lo que puede originarse  la aparición del cáncer de mama. ^(13,14)

Las mutaciones producidas en los genes BRCA1 y BRCA2 se encuentran divididas a lo largo de todo el gen,  dando lugar a un codón de parada (secuencia de trinucleótidos de la molécula del ARN mensajero que señala un alto en la síntesis de proteínas) que a su vez produce la síntesis de una proteína incompleta. ^{(11, 13,14)}

Objetivo:

El objetivo que se pretende conseguir en este trabajo es destacar y describir de forma breve las diferentes pruebas genéticas realizadas en el laboratorio para conocer la presencia o no, de mutaciones en los distintos genes supresores como el BRCA1 y BRCA2 de pacientes con la patología de cáncer de mama o de personas con predisposición genética a su padecimiento.

Metodología:

Para la realización de este trabajo, se ha llevado a cabo una revisión bibliográfica, mediante una búsqueda de información científica relacionada con los objetivos planteados anteriormente. Por esa razón, se han realizado consultas en bases de datos, bibliotecas electrónicas, buscadores, como Pubmed, Cochrane, Scielo, mediagraphic, redalyc, Google académico y libros de ámbito científico con temario relacionado con el tema expuesto.

Las indagaciones realizadas en los distintos buscadores y páginas científicas, fueron las siguientes: Pubmed 8 búsquedas de las que se han utilizado 4 referencias, Cochrane 6 búsquedas de las que se han utilizado 2 referencia, Scielo 15 búsquedas de las que se han utilizado 7 referencias, Google académico 18 búsquedas de las que se han utilizado 4 referencias. Libros de ámbito científico 15 búsquedas de las que se han utilizado 8 referencias.

Consideraciones:

El ADN de las células eucariotas es una proteína muy compleja formada por una doble cadena enrollada y compuesta por nucleótidos. Esta cadena posee una gran estabilidad gracias a sus enlaces de puentes de hidrógeno, enlaces entre bases nitrogenadas y enlaces disulfuro. En el interior de esta doble hélice podemos encontrar toda la información genética que posee el individuo. Esta información genética posee unas unidades mínimas que reciben el nombre de genes, consistentes en una secuencia determinada de los nucleótidos que forman la doble hélice, permitiendo que se produzca la transmisión hereditaria de los mismos ^(1,23).

Se sabe que el genoma humano es una secuencia de 3.000 millones de nucleótidos (adenina, citosina, guanina y timina) que contiene alrededor de 40.000 genes. ⁽¹⁵⁾

Para conseguir la extracción de ADN es necesario destruir las membranas nucleares ya que aquí, en el núcleo, es donde se encuentra esta doble cadena. Al romperse las membranas se liberan los ácidos nucleicos que pueden precipitarse de manera sencilla para su obtención. ⁽¹⁶⁾

A lo largo del tiempo, se han utilizado diversas técnicas de extracción de ADN de coste bajo y métodos sencillos, una de estas técnicas es en la que utiliza fenolcloroformo-alcohol isoamílico (FCl). Esta técnica es muy eficaz, pero tiene la desventaja de ser  dificultosa y utilizar productos tóxicos, además, contiene inhibidores que interfieren en la reacción de la polimerasa en la PCR ⁽¹⁶⁾.

Lahiri & Nurnberger en 1991 realizaron una técnica de extracción de ADN por gradientes de sales (MgCl2, KCl, NaCl, EDTA, Tris-HCl).  Esta técnica consiguió extraer ADN con calidad lo suficientemente alta como para realizar un análisis molecular mediante la realización de una PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism) ⁽¹⁶⁾.

Este tipo de extracción, al contrario de la anterior, utiliza menos productos tóxicos y no posee ningún tipo de inhibidor para la PCR, aunque el mayor inconveniente es su dificultad de realización. De manera actual, tenemos diferentes kits comerciales que realizan una purificación y extracción del ADN de manera sencilla y en un corto periodo de tiempo. ⁽¹³⁾

El método de extracción orgánica, es una técnica usada ampliamente, por la cuál las células se lisan y los restos de estas, que son inservibles se desprecian mediante una centrifugación. Se utiliza una sustancia llamada proteasa la cual desnaturaliza las proteínas, que posteriormente se hacen precipitar mediante la actuación de disolventes orgánicos tales como el fenol o una mezcla de fenol-cloroformo. Una vez precipitadas se centrifuga para su eliminación. Tras haber despreciado lo que no se necesita, solo queda el  ADN que se recupera mediante precipitación con etanol absoluto o isopropanol. En presencia de cationes monovalentes como el Na+, y a temperatura de -20°C, el etanol absoluto precipita eficientemente los ácidos nucleicos poliméricos dejando atrás ácidos nucleicos monoméricos y de cadena corta. Dando lugar a la obtención del ADN purificado ^{(13, 14, 16,17)}.

La técnica de fragmentación del ADN, se desarrolla gracias a unas endonucleasas de restricción, (enzimas que fragmentan el ADN de manera que  cada enzima reconoce una o un número pequeño de secuencias blanco y fractura el ADN en o cerca de esas secuencias). Estas endonucleasas, cortan las cadenas bicatenarias complementarias originando fragmentos de diferentes tamaños en función de la separación de las secuencias reconocidas por la enzima. Posteriormente se realiza una amplificación de dichos fragmentos de ADN dando lugar a una gran cantidad de los mismos. ⁽¹⁷⁾

Para poder llegar al volumen propicio de ADN necesario para realizar la secuenciación de genes, necesitaremos desarrollar una técnica llamada PCR o reacción en cadena de la polimerasa.

La PCR tiene como fin amplificar o reproducir in vitro una cierta cantidad de copias de una región específica de ADN, con la finalidad de copiar la cantidad suficiente de un fragmento para su análisis ⁽¹⁸⁾. Para realizar esta técnica se necesitan unos cebadores o primers, que son secuencias de entre 20 y 30 nucleótidos. Estos cebadores están previamente diseñados y reaccionan con la hebra sencilla de ADN pegándose en lugares específicos por complementariedad de bases.

La PCR consta de las siguientes etapas:

1. a) Desnaturalización de una cadena bicatenaria de ADN separando las 2 hebras complementarias. La desnaturalización, solamente se puede llevar a cabo eliminando los enlaces no-covalentes existentes entre estas dos hebras, ya que estos enlaces son los que mantienen la integridad de la doble cadena. Estas fuerzas no-covalentes pueden ser anuladas mediante altas temperaturas o bajas concentraciones salinas. La reacción finaliza cuando toda la doble hélice se separa pasando de ser ADN bicatenario a monocatenario.
2. b) Hibridación por interacción entre una cadena desnaturalizada, con otra complementaria o sonda, para formar un “híbrido”. Las cadenas separadas se unen a los cebadores, que en presencia de la Taq ADN polimerasa, (enzima que proviene de una bacteria termófila llamada Thermus aquaticus. Se le considera una enzima termoestable y su función es la de producir nuevas cadenas de ADN utilizando las ya existentes como molde) ⁽¹⁹⁾, produce la unión de nuevos nucleótidos complementarios o dntp´s, que se integran durante el proceso hasta constituir la cadena completa de ADN, este proceso se conoce como elongación o extensión, con lo que se obtienen 2 cadenas bicatenarias al finalizar el primer ciclo ⁽²⁰⁾.
3. c) Repetición de los ciclos de extensión hasta que se alcance la dimensión que se había estipulado: se incrementa la temperatura para empezar un nuevo ciclo de replicación del ADN ^(19,20). Anexo 2.

Al finalizar la PCR, podemos llegar a tener miles de millones de copias a partir de una o unas cuantas copias de la región de interés.

De manera posterior a esta técnica,  es necesario realizar un análisis más detallado de la estructura del ADN averiguando la secuencia de nucleótidos. Con el tiempo se han desarrollado distintos métodos para la obtención de esta secuencia del ADN, sin embargo, actualmente los métodos más utilizados son el de secuenciación automática y el método enzimático de terminación de cadena de Sanger también conocido por el método didesoxi ⁽²¹⁾.

La secuenciación del ADN da lugar al orden establecido de las cuatro «bases», que forman la molécula de ADN y que son Adenina, Timina, Citosina, y Guanina. La secuencia transmite la clase de información genética que se transporta en un segmento específico de ADN. Esta secuenciación es utilizada para determinar qué segmentos de ADN contienen genes y cuales transportan instrucciones regularizadas, que activan o desactivan estos genes. También puede informar sobre qué datos de las secuencias pueden producir cambios (mutaciones) en un gen pudiendo llegar a desencadenar  enfermedades ⁽²²⁾.

Conclusión:

Detectar la predisposición genética de desarrollar cierto tipo de cáncer, como en este caso el de mama, en pacientes con antecedentes familiares del mismo, es crucial para la recomendación de una orientación de tipo genético que dará lugar a un beneficio para la determinación del riesgo de esta patología. Este tipo de asesoramiento, es esencial para fomentar la prevención y la detección precoz de dicha enfermedad ⁽²³⁾.

El descubrimiento de los genes BRCA1 y BRCA2 en 1991 y 1994 ha llevado a la práctica la prevención oncológica y pruebas genéticas cada vez más sofisticadas para identificar pacientes con alto riesgo de cáncer de mama de origen hereditario. El beneficio de una prueba genética en cualquier población se debe a la habilidad de la misma de reducir tanto la incidencia como la mortalidad del cáncer de mama. La meta de la prueba genética es reducir el número de cánceres que pueden aparecer después de tener el resultado de la misma, detectando dicha patología en un estadio temprano y ofreciendo óptimos tratamientos. ^(24,25)

Estas pruebas de tipo genético como describimos en apartados anteriores son la extracción de ADN, fragmentación y amplificación del mismo, hibridación y amplificación de las cadenas hibridadas y como prueba final la secuenciación de la muestra de ADN para la detección de posibles mutaciones en los genes de interés. ⁽¹⁹⁾

Dentro de los métodos preventivos utilizados para esta patología encontramos la mastectomía mamaria, que disminuye las posibilidades de padecer este tipo de cáncer en un 90%.^(24,25)

Como conclusión final, destacar la importancia de continuar con  la investigación sobre este tipo de técnicas para poder avanzar de modo que las pruebas necesarias para realizar el estudio genómico de los pacientes lleguen a poder realizarse de manera más sencilla y menos costosa. A su vez es importante también conseguir avances a nivel tanto de tratamientos mediante fármacos como a nivel quirúrgico, para que las personas que desarrollen o pueden llegar a desarrollar esta patología puedan tener una calidad de vida adecuada, tanto a nivel físico como psicológico.

Ver Anexo

Bibliografía:

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